基础肿瘤理论与实践：Apoptosis and cancer

ApoptosisandcancerTodieornottodie,thisisaquestion.蝼蚁尚且贪生。舍生取义。Destiny.“fortheirdiscoveriesconcerninggeneticregulationoforgandevelopmentandprogrammedcelldeath”1090–131=959(cells)RobertHorvitzJohnSulstonSydneyBrennerPhysiologyorMedicineNobelPrize2002SydneyBrenner20世纪60年代末，英国科学家悉尼·布雷内希望能找到一种适于基因水平研究，并能确定完整的神经系统的实验生物模型。最终布雷内选择了一种较为简单的生物——秀丽隐杆线虫。“Hechosethenematodebecauseofitsshortlifecycle,geneticsimplicityandtinysize—lessthan1mmlong”布雷内慧眼识线虫

JohnSulston苏尔斯顿提出“细胞程序性死亡”

利用布雷内建立的突变的线虫株，发现并分离了一系列影响细胞凋亡的基因，包括ced-1、ced-2和nuc-1，提出生物发育过程中细胞的凋亡是由一系列基因控制的。确定了线虫发育过程中每一个细胞的分裂和分化及其最终的命运。Caenorhabditiselegans

1090959131RobertHorvitz

1986年，罗伯特·霍维茨及其学生发现了线虫中在细胞凋亡过程中起关键作用的两种基因：ced-3和ced-4。这两种基因的缺失将改变细胞的命运，使线虫中原本正常情况下会死亡的细胞存活并继续分化下去。

霍维茨等人确认“死亡基因”

细胞凋亡的发现以及对细胞凋亡发生机制的研究，为科学开拓出一个神奇的新领域，意义非常深远。它加深了人类对于生命的认识。对细胞凋亡及其机制的研究将为癌症、糖尿病等许多疾病的治疗提供新的可能的方法。对人类健康事业产生重大影响。蝌蚪尾的消失脊椎动物的神经系统的发育发育过程中手和足的成形过程细胞凋亡(Apoptosis)细胞凋亡由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程。是一个由基因调控的细胞主动结束生命的过程。早在1972年Kerr等已发现从细胞形态、超微结构和生化变化等方面来分析，细胞有二种死亡形式,一种是早被熟知的细胞坏死（Necrosis），另一种是新提出的程序性细胞死亡（Programmedcelldeath,PCD）学说。但该学说到九十年代初才进入研究高潮，现在普遍称之为细胞凋亡（Apoptosis）。Apoptosis:细胞凋亡Necrosis:细胞坏死生理性病理性细胞凋亡与细胞坏死的区别—————————————————————————————————————————————————————————坏死凋亡1.性质2.诱导因素强烈刺激，随机发生较弱刺激，非随机发生3.生化特点4.形态变化6.DNA电泳5.炎症反应7.凋亡小体8.基因调控被动过程，无新蛋白合成，不耗能主动过程，有新蛋白合成，耗能细胞结构全面溶解、破坏、细胞肿胀胞膜及细胞器相对完整，细胞皱缩，核固缩弥散性降解，电泳呈均一DNA片状DNA片段化（180-200bp），电泳呈“梯”状条带溶酶体破裂，局部炎症反应溶酶体相对完整，局部无炎症反应有病理性，非特异性生理性或病理性，特异性无有无BasicFeaturesofApoptosis形态学特征

凋亡的起始：细胞器、染色质等开始变化凋亡小体的形成：质膜包裹染色质和细胞器凋亡小体的消化：被吞噬细胞消化NuclearmorphologicalchangesofHeLacellsinapoptosisprocess

（488nm

400）凋亡的生物化学特征非随机性DNA降解细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻DNA断裂与“梯状条带”(1)DNA断裂与“梯状条带”(2)典型凋亡细胞DNA琼脂糖凝胶电泳（呈现梯状条带）Sub-G1DNA断裂的原位末端标记法（TUNEL测定法）凋亡细胞DNA降解产生缺口和末端，故可用原位缺口翻译或末端标记法显示凋亡细胞。细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻AnnexinV-FITCFluorescencePIFluorescence

TimecourseofapoptosisinTF-1cellsculturedinGM-CSF-freemediumCamptothecin(喜树硷),analkaloidisolatedfromtheChinesetreeCamptothecaacuminata,representsapromisingnewclassofanticancerdrugsthattargettheintranuclearenzymetopoisomeraseI(topo-I).Initialclinicalstudiesofcamptothecinwerehaltedbecauseofsevereandunpredictableadverseeffects.Supportedbydetailedunderstandingoftheirmechanismofactionandfacilitatedbychemicalmanipulationsthathaveamplifiedtheirsolubility,camptothecinshaveadvancedtotheforefrontofseveralareasoftherapeuticanddevelopmentalchemotherapy.Inthepresentstudy,westudythepotentialinvitroeffectofNSC606985,ararelystudiedwater-solublecamptothecinesterderivative,onacancercelllinecalledNB4.Forthispurpose,theexperimentsinFigure2weredone.根据以上结果，作者认为NSC606985能够诱导NB4细胞发生凋亡。请回答：

作者得出该结论的依据是什么？（10分）；

在得出如上结论后，作者应该如何开展更深入的研究（10分）。HowdoesApoptosisoccur?Caenorhabditiselegans

1091960131细胞的凋亡至少受14个基因的控制

CED-9CED-4CED-3APOPTOSIS具严格底物特异性的半胱氨酸蛋白酶通常以酶原（前体）的形式存在于细胞内活化的Ced–3特异地降解蛋白底物CED-9CED-4CED-3EGL-1

EGL-1

CED-3CED-41993年，袁钧英等发现Ced-3基因与哺乳细胞白细胞介素－1β转化酶(interleukin-1b-convertingenzyme,ICE)存在功能和序列相似性。和Ced-3一样，ICE的高表达可导致啮齿动物成纤维细胞凋亡。

Caspases:cysteine-containingaspartate-specificprotease（含半胱氨酸的天冬氨酸特异水解酶）

是一组对底物的天冬氨酸部位有特异水解作用，其活性中心富含半胱氨酸的蛋白酶。Caspase家族的结构与分类ICE亚类Caspase蛋白酶：ICE是单核细胞来源的参与成熟的一种蛋白酶，参与凋亡但不起主要作用；Caspase1，Caspase4，Caspase5，Caspase11Caspase12，Caspase13，Caspase14。凋亡启动亚类Caspase蛋白酶：Caspase8，Caspase2，Caspase9，Caspase10。凋亡效应亚类Caspase蛋白酶：Caspase3，Caspase6，Caspase7prodomain大亚基（~20KD）小亚基（~10KD）Caspase前体大亚基（~20KD）小亚基（~10KD）活化(p20/p10)2Caspase属于半胱氨酸蛋白酶。具有严格的底物特异性，即特异地剪切天冬氨酸残基后的肽键。但是，邻近剪切位点N端的四肽序列及其结构对于caspases的有效酶解也是非常重要的。不同caspases识别的四肽序列明显不同，这可能是造成它们的功能差异的重要基础。使抑制凋亡因子失活，如ICAD破坏细胞结构，如LaminA将调节区与催化区分离，使蛋白失活，如PARPCAD激活方式MolecularpathwaysofapoptosisTwoprinciplepathways

ExtrinsicIntrinsicpathway参与死亡受体信号转导的接头蛋白：（死亡结构域蛋白deathdomainprotein）TRADD：TNF受体相关死亡结构域蛋白TNF+TNFRI（死亡结构域）+TRADD—细胞凋亡FADD：Fas相关死亡结构域蛋白FasL+Fas（死亡结构域）

+FADD—细胞凋亡RIP：受体相互作用蛋白CRADD：含有死亡结构域的caspase和RIP接头蛋白MADD：活化MAP激酶的死亡结构域蛋白Receptor-mediatedpathwayofapoptosisFASL+FAS+FADD

死亡诱导信号复合物（DISC）胞质中游离的caspase8聚集到这个复合物上细胞有足够caspase8细胞caspase8浓度不够死亡受体活化，切割BidtBid从胞质到线粒体细胞凋亡

CtyC释放Themitochondria-mediatedpathwayofapoptosis线粒体参与细胞凋亡或坏死的途径释放caspase活化因子细胞色素C：细胞色素C+Apaf-1+caspase9—凋亡体AIF（凋亡诱导因子）Caspase3Apaf-1：凋亡蛋白酶活化因子时间主要发现参考文献1994年首次提出线粒体在细胞凋亡中是不可缺少的Newmeyer,etal.1996年线粒体中细胞色素C的释放引起细胞凋亡Liu,etal,[5]1997年证明Caspase-9在细胞色素C和dATP存在时与Apaf-1结合并被激活，再激活Caspase-3Li,etal.[6]1998年膜死亡受体通路通过Bid作用于线粒体信号通路Luo,etal.[24]1999年线粒体

释放AIF参与凋亡的发生SusinSA,etal.[9]2000年线粒体释放Smac/DIABLO参与凋亡发生Du,etal[10].Verhagen,etal[11]2001年

线粒体释放核酸内切酶G引起“DNA

ladder”

的产生Li,etal.[12]

线粒体释放Smac样的丝氨酸蛋白水解酶HtrA2/Omi，后者通过抑制IAP促进细胞凋亡Suzuki,etal.[19]细胞凋亡线粒体信号通路研究中的重要发现

凋亡诱导因子（apoptosis-inducingfactor,AIF）

Smac/DIABLO（secondmitochondria-derivedactivatorsofcaspase/directIAP-bindingproteinwithalowisoelectricpoints）

核酸内切酶G（endonucleaseG，EndoG）57KD黄素蛋白AIF(Mit)NucleusChr浓缩DNA降解IndependentofcaspaseactivationandoxidoreductasesactivityofAIFGuidoKroemerEarlyworkontheroleofmitochondriainapoptosisWorkonperipheralT-celltoleranceinMadridin1989WetreatedmicewithSEB,asurperantigenwhoseinjectioncaninduceT-celltolerancethroughactivation-inducedcelldeath.DNAladderApoptosisofperipheralTcellswasaninvitroartefactJExpMed,1993IdecidedtolookforbiochemicalalterationsthatwoulddistinguishnormalTcellsandpreapoptoticTlymphocytes.pH,cationconcentrations,membranepermeability,lysosomechangeandsoon.DiOC6,adyethatindirectlymeasuresthemitochondrialtransmembranepotential(JEM,1995)LossofMTPmarkedairreversibleearlystepoftheapoptoticprocess(JEM,1995)Acellfreesystem,inwhichweconfrontedpurifiedmitochondrialwithpurifednuclei.Uponinductionofpermeabilitytransbilitytransition,wefoundthatmitochondriareleasedanapoptosisinducingfactorthatcausechromatincondensationandfragmentationwhenaddedtopurifiednulclei.(JEM,1996)ThemitochondrialreleaseoftheseapoptogenicfactorsbutnottheiractiononthenucleuswasfoundtobecontrolledbyBcl-2.(JEM,1996)Mitochondrialwoulddecidethefateofcellsandservesasacentralintegratorandcoordinatoroftheapoptoticprocess.(FASEBJ,1995)Mitochondrialarebullshit!?Withoutthishelp,wewouldhavebeenforcedtoabandonourworkXiaodongWangDouglasGreenCellfreesystemofxiaodongwangCellfreesystemofkroemerTodetectcaspaseactivationasthefinalreadoutTolookforaproteinthatwouldcausechromatincondensation,intheabsenceofcytosol,inacaspase-independentmanner.AIF(Nature,1999)Artefact-inducingfactor?Itisprobablywrongtoconcentrateonjustoneorfewproteins(ANT,VDAC,p53)asbeingcrucialregulators,weshould,atleastsometimes,concentratedonprocesses,ratherthanonindividualmolecules.CytoC,HowapoptosisisregulatedTsujimoto和Crose发现极大多数非何杰金氏滤泡状B细胞淋巴瘤(B-celllymphomas)存在染色体易位t(14;18)。caspasesApaf-1?14号染色体的IgH基因—Bcl(Bcelllymphoma)-2基因基因转染实验显示Bcl-2高表达广泛抑制大多数刺激剂诱导的细胞凋亡。

Bcl2含有1-4个Bcl-2同源结构域（BH1-4）。分两类：抗凋亡基因，如：Bcl-2；促凋亡基因，如：Bax。促凋亡蛋白能引起线粒体外膜通透性改变，导致cytc释放，引起凋亡。bcl-2相当于线虫的ced9。主要定位于线粒体膜、也存在于ER和外核膜，拮抗促凋亡蛋白的功能。bcl-2基因家族Bcl-2genefamily（Zimmermann2001）EarlyworkonthefunctionofBcl-2DavidVauxFulllengthofbcl-2cDNAwasclonedin1986bybothTsujimotoinPhilidelphiaandMikeClearyatStanford1987,receivedthebcl-2cDNAfromMikebutwasaskednottomaketransgenicmice.Tofigureoutwhetherbcl-2wasanoncogenewhoseoverexpressionwasresponsibleforcausingfollicularlymphomaToseeifitcouldactlikeotheroncogenetotransformfibroblasts,ashadbeenshownforras,v-raf,ormakegrowthfactordependentcellsfactorindependent,ashadbeenshownforv-abl,v-fms.NIH-3T3FDC-P1:IL-3dependentInfectedwithbcl-2InfectedwithvectorInjectedintosyngeneicmiceGrowthfactorwithdrawGrowthfactorwithdrawNocoloniesNocoloniesNotumorsgrowImmunologytoday,1989DeathDNAladderNodeathNoDNAladderWhetherbcl-2andc-myccouldsynergizeinthetransformationofcellsinvitro.NormalbonemarrowcellsEμ-mycbonemarrowcellsBcl-2SoftagarSoftagar?lymphomaNature,1988F1cross(1989,5)Transgenicbcl-2mice(1988,9)TransgenicEμ-mycmicePre-orpro-BcellleukemiasNature,1990ThinkingthatevolutionmightprovidesomecluesastohowBcl-2functioned,IthoughtI’dmakeazooblot,andprobeitwiththehumanbcl-2cDNA.Mouse,Drosophila,Xenopus,herring,yeast,C.elegansDNAMaketrangenicwormswithhumanbcl-2Thewormsexpressinghumanbcl-2hadonlyathirdasmanycorpsesasthecontrolScience,1992Hengartner,M.O.2000.Nature.407:770.Green,D.andKroemer,G.1998.TrendsCellBiol.

8:267.Mitochondrial