细胞培养技术实验细胞培养的无菌操作-大学课件-

细胞培养的无菌操作【培养前准备】根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。这可以避免开始实验后．因物品不全往返拿取而增加污染机会。【操作野消毒】无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面—次(拖布要专用)．紫外线照射消毒

30-50min，超净工作台台面每次实验前要用75％酒精擦洗。然后紫外线消毒30min。在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线，消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置．否则会遮挡射线降低消毒效果。—些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。【洗手和着装】原则上和外科手术相同。平时仅做观察不

做培养操作时，可穿经细胞培养室内紫外线照射30min的清洁工作服。在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，并于开始操作前要用75％酒精消毒手。如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。【火焰消毒】一切操作，如按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。但要注意：¨

金属器械不能在为焰中烧的时间过长，以防退火，烧过的金属镊要待冷却后才能挟取组织，以免造成组织损伤。¨

吸取过营养液后的吸管不能再用火焰烧灼，因残留在吸管头中营养液能烧焦形成炭膜，再用时会把有害物带入营养液中。¨

开启、关闭长有细胞的培养瓶时，火焰灭菌时间要短。防止因温度过高烧死细胞。¨

胶塞过火焰时也不能时间长，以免烧焦产生有毒气体，危害培养细胞。【操作】¨

动作要准确敏捷，但又不必太快。¨

不能用手触及已消毒器皿的使用端。¨

右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。¨

培养液在未用前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口。¨

吸取营养液、PBS、细胞悬液及其它各种用液时，均应分别使用吸管。¨

工作中不能面向操作野讲话或咳嗽手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上方。¨

瓶口最易污染，加液时如吸管尖碰到瓶口，则应将吸管丢掉。实验二常用仪器设备的使用一、实验目的掌握细胞培养中常用仪器设备的使用和保养方法二、器材¨

双重纯水蒸馏器¨

CO2培养箱¨

压力蒸汽消毒器¨

净化台¨

倒置显微镜三、操作（1．一投）入C运O2行培前养的箱准备工作给培养箱和附件进行消毒：用75％酒精浸泡

过的纱布擦拭培养箱内壁和附件进行灭菌消毒，然后用无菌干纱布将酒精擦除干净，这项工作

应定期进行。待箱内酒精挥发干净后，将箱内温度设定为37℃，CO2浓度设定至0％（设定方法见下面

的相关内容），这种状态维持8h以上。这步操作适用于首次启动运行或长时间未用。用配套的供气管将CO2储气瓶的减压器与培养箱连接起来。注意检查接点是否漏气。（一）CO2培养箱气瓶减压器是用来调节CO2供气量的装置，它由双表组成，左表是低压表，右表是高压表，高压表连接螺杆。其使用方法如下：①打开CO2储气瓶前，先按逆时针方向旋转减压器调节螺杆，直到调节弹簧不受压力为止。②把CO2储气瓶阀门缓慢打开，高压表指示瓶内气体量读数。③按顺时针方向轻轻旋转减压器调节螺杆，使

CO2减压，当低压表指针指到0.03Mpa时，松动低压

表的出口，使CO2气体缓慢流入培养箱。若压力超过

0.03Mpa时，需再旋转螺杆，放出一部分气体后再调节。整个调节过程要细心、缓慢，若进入培养箱的

CO2压力过高，可冲破培养箱的CO2调节装置或将供

气管弹开，导致CO2培养箱CO2调节量失控。（一）CO2培养箱2．设定培养箱温度和CO2浓度通常CO2培养箱的使用条件为37℃，5％CO2。其设定程序见下表：所操作的键SET操作说明操作之后的指示1打开电源开关温度指示器显示当前箱内温度2按SET键温度指示器中数字闪烁按ENT存储设定温度；CO2指3按下 键和 键，按下该键，可使数字移位将数字设定到37.0下该键，可使数字增加4按下ENT键示器中数字闪烁。5按下 键和 将数同3字设定到05.0同3注意：在设定状态中，当不进任何键操作持续90s之后，指示器将自动恢复到当前温度和

CO2浓度显示状态。在设定状态中，如不需要改变设定值，则按下SET便可跳到下一种设定状态。当旋转上限报警温度旋钮时，即使不处于设定状态，上限报警温度都将改变。（二）双重纯水蒸馏器1、插上电源，打开冷凝水。2、打开水源，直到多余水从初次蒸馏的水位器溢水口流出。这时横式烧瓶中水位达到一半高度，按A键指示灯亮，仪器进入加热状态开始蒸馏。当纯水进入二次蒸馏的横式烧瓶一半水位高度后，按B键指示灯亮，仪器进入二次蒸馏。若按B键指示灯不亮，只要把蓝色塑料套管上下抽动直到灯亮。以后随着水位高低A、B按键能自动开关。3、冷凝管过热，温度控制器触点断开会切断电源。

待3－5分钟冷凝管温度降低，仪器会自动接通电源。4、在操作过程中，调整簧管和磁性浮子的配合位置应以水位降低时能自动切断电源为准。（三）倒置显微镜接通电源。聚光镜上的环形光栏推到通光孔处。使双目镜筒的镜距与人的两眼瞳距相一致。把标本放到载物台上，10X物镜转入光路，旋转粗微动手轮，使标本成像，要使影像更清楚，还可以调整一下光线的强弱。在进行相衬观察时，把相衬片插入聚光镜中，将孔径光栏开至最大，把相衬物镜（10X-）转入光路，即可进行相衬观察。四、注意事项1、使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。培养瓶相互保持足够的距离，间隔不足则有可能造成

箱内温度和二氧化碳浓度分布不均匀。②保持培养箱内清洁干净。存放于箱内的培养瓶先用酒精棉擦拭干净；定期对培养箱内壁及其附件进行消毒；培养箱内壁有冷凝水时，需用无菌纱布擦拭。③给增湿盘注入无菌蒸馏水，以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。如果增湿盘水位降低，则应将水补足。此外，每月对增湿盘进行一次清洗。④取放培养物时要快速，减少二氧化碳的消耗。四、注意事项2、使用双重纯水蒸馏器应注意的问题：3、使用倒置显微镜应注意的问题：①擦拭镜头表面时，若去灰尘可用软刷或纱布，若清除指纹和油迹，可用沾有二甲

苯的擦镜纸或柔软纱布擦拭。②勿随便拆卸。③仪器应放在干燥处。五、结果与讨论每组制备至少500mL的三蒸水，记录实际体积。绘制倒置显微镜所观察到的影像图。讨论本次实验操作的难点和解决方法。实验三细胞培养用品的清洗、包装和消毒一、实验目的掌握细胞培养常用实验器材的清洗要领、清洗步骤和注意事项。掌握细胞培养常用器材的包装要领和要求。掌握除菌滤器的安装、使用和拆除方法及操作注意事项。二、实验原理离体条件下，有害物质直接同细胞接触，细胞对任何有害物质十分敏感，极少残留物都可以对细胞产生毒副作用。因此，新的或重新使用的器皿都必须认真清洗，达到不含任何残留物的要求。微生物污染是造成细胞培养失败的主要原因，因此细胞培养用品在培养细胞前，要消毒或灭菌。对细胞培养用品进行消毒前，要进行严密包装，以便于消毒和贮存。三、器材培养皿（3）100mL培养瓶（4）25mL培养瓶（2）尖吸管（5）5mL或10mL移液管（3）青霉素小瓶（3）血球计数板（1）盐水瓶（1）离心管（2）250mL烧杯（1）100mL烧杯（1）50或100mL玻璃注射器■1.玻璃器皿：三、器材2.金属器械：解剖刀（1）大号圆头镊（1）眼科剪（3）眼科镊（3）100目金属筛网（1）正压除菌滤器三、器材3.橡胶、塑料制品：青霉素瓶塞（4）小橡皮吸头（6）大橡皮吸头（4）盐水瓶翻口塞（1）针头滤器（5）培养瓶盖（2小、4大）三、器材4.其它：5mL一次性注射器（5）金属饭盒（1）纱布棉花

牛皮纸记号笔剪刀

棉绳

铝箔四、试剂和材料¨

5％盐酸¨

清洁液（酸液）¨

0.5mol/L

NaOH¨

0.5mol/L

HCl¨

三蒸水¨

75％酒精五、操作（一）玻璃器皿的清洗、包装和消毒

1．玻璃器皿的清洗一般经过浸泡、刷洗、浸酸、和清洗四个步骤。1）浸泡 新的或用过的玻璃器皿都要先用清水浸泡，软化和溶解附着物。新玻璃器皿使用前得先用自来水简单刷洗，晾干或烘干（50℃）后用5％盐酸浸泡过夜，然后用自来水反复振荡冲洗后备刷洗；用过的玻璃器皿用后应立即浸入清水中备刷洗。刷洗将浸泡后的玻璃器皿放到洗涤剂水中，用软毛刷反复刷洗。不要留死角，并防止破坏器皿表面的光洁度。将刷洗干净的玻璃器皿洗净、晾干或烘干（50℃），备浸酸。浸酸浸酸是将上述器皿浸泡到清洁液中，又称酸液，通过酸液的强氧化作用清除器皿表面的可能残留物质。浸酸不应少于六小时，一般过夜或更长。浸酸时放取器皿要小心。4）冲洗 刷洗和浸酸后的器皿都必须用水充分冲洗，浸酸后器皿是否冲洗的干净，直接影响到细胞培养的成败。手工洗涤浸酸后的器皿，每件器皿至少要反复“注水－倒空”15次以上，最后用三蒸水浸洗2－3次，晾干或烘干（50℃）后备包装用。玻璃器皿的包装包装材料常用牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、较大培养皿、铝箔等。小的培养器皿用牛皮纸包装后再装入饭盒内，较大的器皿可以进行局部包扎。玻璃器皿的消毒玻璃器皿的消毒可以用高温湿热灭菌（20－30min和高温干热消毒（160℃保持90－120分钟）。（二）橡胶制品的清洗、包装与消毒橡胶制品的清洗橡胶制品洗涤方法：浸泡后，2%NaOH煮沸15

分钟，流水冲洗，1%HCl煮沸15分钟(或浸泡

30分钟)，流水冲洗，蒸馏水煮沸20分钟，三蒸水浸洗2-3次，晾干或50℃烘干备用。橡胶制品的包装细胞培养用的橡胶制品一般较小，用牛皮纸包装后再装入饭盒内。橡胶制品的消毒高温湿热灭菌。（三）塑料制品的清洗、包装与消毒塑料制品的清洗塑料制品质软、易出现划痕；耐腐蚀能力强、但不耐热。其清洗程序：使用器皿后立即用清水清洗，浸于自来水过夜，用纱布或棉签和

50℃稀洗液刷洗，流水冲洗（15－20遍），晾干，浸于清洁液15分钟，流水冲洗（15－20遍）,蒸馏水浸三次，三蒸水泡24小时，晾干或50℃烘干备用。塑料制品的包装细胞培养用的塑料制品一般较小，用牛皮纸包装后再装入饭盒内。塑料制品的消毒高温湿热灭菌。（四）金属器械的清洗、包装与消毒金属器械的清洗放到含洗涤剂的水中，反复刷洗后，自来水反复冲洗干净，晾干，用75％酒精擦拭，自来水反复冲洗干净，最后三蒸水浸洗3次，晾干或50℃烘干备用。金属器械的包装较小的金属器械用牛皮纸包装后再装入饭盒内。

3．金属器械的消毒金属器械的消毒可以用高温湿热灭菌（20～30min）和高温干热消毒（160℃保持90－120分钟）。（五）正压除菌滤器的清洗、包装与消毒正压除菌滤器的清洗放到含稀洗涤剂的水中，反复刷洗后，流水冲洗15min漓水，蒸馏水浸泡24h，三蒸水浸泡24h，晾干或50℃烘干备用。正压除菌滤器的包装在包装前应将滤膜装好（滤膜在使用前需经三蒸水浸泡过夜，安装时使用两层0.22μm的滤膜，光面朝

上），然后用铝箔或牛皮纸包好正压除菌滤器的出液口和进气口，再用棉布将整个正压除菌滤器团团裹住，并捆好。正压除菌滤器的消毒121℃高压湿热灭菌20min。（六）针头滤器的清洗、包装与消毒针头滤器的清洗、包装与消毒同塑料制品，但是包装前应将滤膜装好，安装滤膜的

注意事项和要领同正压过滤器。实验四动物细胞培养用液的配制和无菌处理一、实验目的掌握配制细胞基础培养液（RPMI-1640、DMEM等）的方法和操作要求。掌握抗菌素、消化液及Hanks液的配制方法。进一步学习无菌操作，练习各实验器材的使用方法。练习细胞用液分装方法。二、实验用品试管架、记号笔、圆头镊、广口瓶

火柴、1000mL烧杯、不锈钢正压滤器针头滤器、大、小滤膜、一次性注射器玻璃注射器三、操作（一）Hanks液的配制配方：甲液：NaHPO4·2H2O0.06克KH2PO40.06克MgSO4·7H2O0.20克葡萄糖1.00克NaCl8.00克三蒸水750毫升乙液：CaCl20.14克三蒸水100毫升配制程序：1、将乙液徐徐加入甲液中。2、将0.35克NaHCO3溶解在37℃100毫升三蒸水中。3、用数滴NaHCO3液溶解0.01克酚红。4、将2、3液逐滴、搅拌加入到1液中。5、用三蒸水定容至1000毫升，充分混匀，4℃冰箱过夜。6、滤过消毒，小瓶分装，冷藏。配制注意事项：¨

配制时各种药品要依次溶解¨

含Ca2+和Mg2＋的物质因容易出现沉淀，配制时要单独溶解，然后在不断搅拌下加入。（二）血清的灭活处理1、选用与血清瓶同规格的对照瓶一个。2、对照瓶内放入与血清等体积的水。3、对照瓶内插入准确的温度计，放入水浴锅中，接通电源，调节温度控制钮，使温度计温度保持在56℃。4、血清瓶与带温度计的对照瓶一齐放入水浴锅中，待温度计所示温度上升至56℃时，定时30min。5、大瓶血清灭活后，进行分装。6、分装后，抽样做无菌试验，－20℃～－70℃保存。（三）0.25％胰蛋白酶的配制1、称取0.25克酶粉，用少量已消毒的D-Hanks液将胰蛋白酶粉调成糊状。2、加适量已消毒的D-Hanks液，磁力搅拌3～5天即可溶解（室温和4℃间断进行，室温高于

30℃要减少酶液在室温中的搅拌时间），溶解完全后定容至100mL。3、溶解后的酶液（深红色）滤过除菌，分装，－20℃冻存。（四）RPMI-1640的配制1、溶解培养基：将干粉培养基溶于总量1/3的三蒸水中，再用水洗包装袋内面两次，倒入培养液

中。振荡或超声助溶，一般不要加热助溶。2、补加试剂：根据包装袋说明和试验需要加入

NaHCO3（2.0g）、谷氨酰胺、丙酮酸钠、

HEPES等其他试剂。3、加抗生素：一般抗生素终浓度为――青霉素100U/ml，链霉素100U/ml。市售青霉素为80万U／瓶，可溶于4ml体积，每一升培养液中加

0.5ml即可。市售链霉素为100万U／瓶，可溶于5ml体积，每一升培养液中也加0.5ml即可。（四）RPMI-1640的配制4、调pH值：加水到900ml（在需要加10％小牛血清的情况下），然后用5％NaHCO3调节pH到7.2，加水定容到终体积(必要时用1

mol/L盐酸和1

mol/L氢氧化钠调节pH)。5、过滤除菌：宜采用0.45um和0.22um滤膜各一张，上层为0.45um，下层为0.22um，以保证过滤效果。注意滤膜正面（光面）朝上。过滤后分装于小瓶中（100或200ml）。6、加小牛血清：根据培养基配制的量将小牛血清分装，冷冻保存（－20℃）。临用前加入小牛血清(10%~20%)。四、注意事项1、新鲜三蒸水应贮存与棕色磨口试剂瓶中，三蒸水存放时间不要超过两周，最好现制现用。2、培养液配好后，应先抽取少许放入培养瓶内，于37℃温箱内置24～48hr，以检测培养液是否有污染。3、每次配液量以两周左右为宜，一次配液不要太多，防止营养成分损失或者污染。实验安排¨

第一组：1）Hanks液的配制和分装：分装在

100mL的培养瓶中，每瓶50mL，剩余的装在盐水瓶中。2）值日：领取DMEM培养基、

Hepes、青霉素、链霉素、5mL一次性注射器

10～15根；蒸三蒸水。¨

第二组：1）Hanks液的配制和分装：同上。2）10月19号（下星期三）完成CO2培养箱和无菌室的消毒工作；解冻分装好的小牛血清；培养瓶的灭菌工作。实验安排¨

第三组：胰蛋白酶液的配制和分装：分装在

25mL的培养瓶中，每瓶15mL，剩余的装在小盐水瓶中。¨

第四组：1）小牛血清的灭活和分装：分装在

25mL的培养瓶中，每瓶12.5mL，剩余的仍装在小牛血清瓶中。2）准备酒精棉。¨

第五组：培养液的配制和分装：分装在100mL的培养瓶中，每瓶50mL，剩余的装在盐水瓶中。¨

每组再清洗、包装和灭菌4个培养瓶。注意：用完的器皿要及时浸泡和清洗实验五鸡胚成纤维细胞的原代培养一、实验目的掌握单层细胞培养法（组织消化培养法）培养细胞的基本方法和操作过程。进一步练习动物细胞培养过程中的无菌技术。初步掌握在倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况。二、实验原理所有组织中都有一定量的细胞间质（纤维和基质等），对细胞生长有妨碍作用（妨碍营养物质的穿透），用胰酶消化能除去间质，使组织松散成单个细胞或小的细胞团，细胞易于生长。三、器材超净工作台、二氧化碳培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、酒精灯、吸管、培养瓶和盖、

解剖剪、眼科剪、烧杯、镊子（尖头、圆头

和弯头）、离心管和盖、离心机、血球记数

板、100目不锈钢筛网、青霉素瓶和盖、培养皿、水浴锅实验结束后注意清洗用过的实验器材，为下周实验做准备。下周实验所需器材清洗、包装好后交给第四组同学在下周三时灭菌。四、试剂和材料¨

Hanks液¨

75％酒精（用于浸泡金属器械）¨

0.25％胰蛋白酶¨

DMEM培养液(含小牛血清及青、链霉素)¨

鸡胚：孵化10天的受精蛋五、操作1、取材取孵化10天的鸡蛋，用75％酒精消毒弹壳，小心取出鸡胚，放于无菌培养皿中，用解剖剪或解剖刀除去头部，然后用弯头眼科镊夹起腹部皮肤，剪开腹腔和胸腔除去内脏。2、漂洗和剪切将胚体放入另一培养皿中，用Hanks液清洗3次去除血污，切成几小块，然后转移到无菌青霉素瓶中，在青霉素小瓶内用眼科剪反复剪成

1mm3的小块。3、消化加入适量0.25％胰蛋白酶溶液，一般每个鸡胚加2mL消化液，盖好橡皮塞，置37℃水浴中消化20～30min，消化时每隔5min摇动一次，使组织块散开。视组织块变得疏松，颜色略变白时，从水浴中取出，在超净工作台中用吸管轻轻吸去消化液，加入2～3mL含小牛血清的培

养液，以终止消化。然后用吸管反复吹打，使大部分组织块分散成单细胞状态，静置片刻，让未被消化完的组织自然下沉，然后将上层液通过100目不锈钢筛网，制备细胞悬液。将细胞悬液移入无菌离心管中备用。4、离心和计数离心（800r/min,10min），弃去上清液，加入适量培养液，用吸管轻轻吹打混匀后取样计数。根据计数结果用培养液调整细胞浓度为1×106个/mL。5、接种培养每瓶培养瓶接种4mL细胞悬液，再添加6mL培养液，轻轻混匀后，盖紧瓶塞，标上细胞名称，组号和接种日期等，置37℃、5％CO2培养箱中开放培养（旋松培养瓶盖）。6、观察¨每天要对接种培养的细胞做常规性检查，观察的主要内容是：污染与否、细胞生长状态、PH（通过培养液颜色变化），如发现培养液变为黄色且又混浊，表明已被污染，这时细胞不易贴壁生长，逐渐死亡。如培养液为桔红色，一般说明细胞生长状态良好。¨在没有发生污染的情况下，一般按规24h，可见到许多细胞贴壁，由圆形悬浮状态的细胞延展成短梭状，随着培养时间的增加，逐渐呈现出具有长突起的梭形、星形或三角形的细胞形态。¨由于细胞生长旺盛，代谢产物堆积，CO2增多，培养液逐渐变酸呈黄色，但液体澄清，此时换液一次。一般每2～3天换液1次。细胞计数培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。一般用血球计数板计数。每个大方格的体积为0.1mm3计数板（25X16）的结构及测定原理菌悬液浓度＝【25

*

（A/5）

*

B】/0.00001=50000A*BA—5个中方格中细胞总数B—菌悬液的稀释倍数中格结构图计数方法1、将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。3、静置3分钟。4、镜下观察，计数板五个中格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：细胞数/ml＝50000A*B，A—5个中方格中细胞总数；B—菌悬液的稀释倍数注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。培养液换半量方法：¨

瓶口消毒。¨

从瓶侧面吸去原培养液量的一半。¨

从瓶侧面补加等体积新培养液。¨

翻转培养瓶，使培养液覆盖细胞面，瓶口消毒加塞。注意：培养液要事先预热至37度。六、结果与讨论日期培养液颜色变化细胞生长情况描述1．实验记录表2．写出本次实验个人操作体会。注意写明实验中每一步是由谁参与操作的。实验六乳鼠肺细胞的原代培养组织块培养法一、实验目的¨

1．学习和掌握组织块培养法培养细胞的基本方法和操作过程。¨

2．进一步掌握动物细胞培养过程中的无菌技术。¨

3．掌握在倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况。二、实验原理组织切成0.5-1mm的小块后，由于组织块

体积很小，在不加任何粘着剂的情况下，它们也能直接贴附于瓶壁上，然后细胞

从组织块边缘向外长出生长晕，最后连

接成片而形成单层细胞。此方法程序简

化，是常用的原代细胞培养方法。三、器材¨

超净工作台¨

二氧化碳培养箱¨

普通显微镜¨

倒置显微镜¨

酒精灯¨

吸管¨

培养瓶¨

解剖剪¨

眼科剪¨

烧杯¨

镊子（尖头、圆头和弯头）四、试剂和材料¨

Hanks液¨

75％酒精¨

RPMI－1640培养液(含小牛血清及青、链霉素)¨

新生乳鼠（小鼠）五、操作（一）取材1、取新生乳鼠一只。2、采用颈椎脱臼法处死，然后把这个小鼠浸入盛有75%酒精的烧杯中2-3秒（默数

5下）。3、随即携入超净工作台内，小鼠仰位放置到灭菌的培养皿中。4、用75％酒精消毒胸廓部位皮肤。5、打开消毒器械包，在胸廓正中线位处，用眼科弯镊夹起乳鼠胸部皮肤（多夹些）,用解剖剪开适当位点后,用两把眼科弯镊向左右两侧撕拉，皮肤外翻固定，充分暴露躯干部肌肉（注意：不要使表皮面接触到已暴露出来的胸腹肌）。酒精消毒乳鼠胸廓后，换一套金属器械，沿着

隔膜剪断胸廓，并将胸骨两侧肋骨剪断。胸廓

暴露后，可见跳到的心脏和粉红色的肺。换一

把弯头眼科镊，将弯头向下，从心脏右上方插

入心肺连接处，轻轻向上用力，将心肺一齐取

出，放置在灭菌的培养皿中，用镊子去除心脏，肺移入已加Hanks液的青霉素瓶内。（二）漂洗用Hanks液清洗肺脏表面血污，然后用眼科直剪粗剪几下，再用Hanks液漂洗多次，去净血污，将洗净的组织块置青霉素小瓶一角，然后将有组织块的瓶面翻向上方，吸去流向对侧的多余液体。（三）剪切用眼科直剪将洗净的组织块反复剪成0.5-1立方毫米的小块，此过程需20～30分钟（剪切时为保持组织湿润，可向组织块滴加1～2滴培养液）。然后用吸管滴加几滴培养液，轻轻吹打混匀。（四）接种和培养用润湿的吸管分次吸取小碎块悬液，注意吸在吸管前端部，以免吸得过高，使组织小块粘附于管壁而丢失。将组织碎块在培养瓶底部均匀放置（块距0.3cm大小），25毫升培养瓶放20～30块为宜。然后轻轻翻转培养瓶，加入适量培养液(液层厚约15mm)盖好，标记好，置37℃孵箱中培养4-24小时。待组织小块略干燥，能牢固贴在瓶壁时，再慢慢翻转培养瓶，使培养液浸泡组织块，静置培养。操作过程中动作一定要轻，减少振动，否则会使组织块脱落，影响贴壁培养。（五）观察¨

静置培养3天后开始在显微镜下观察细胞生长情况。注意观察培养组织小块边缘是否长出新细胞。一般最先出现的是形态不规则的游走细胞,接着是成纤维细胞或上皮细胞。当细胞分裂，细胞数量增多时，在组织块周围可见到生长晕。随后细胞生长分裂增快，呈放射状向外扩展逐渐连成一片。¨

注意检查有否污染。¨

可根据培养液颜色，更换培养液。¨

约10-15天后细胞可长成单层，即可传代培养。实验七 动物细胞的传代培养一、实验目的¨

掌握动物细胞培养传代的基本方法和操作过程。二、实验原理¨

当原代培养细胞或细胞系细胞增殖达到一定密度后（一般形成致密单层），则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，以适当比率转移到另一个或几个容器中

扩大培养，此过程为传代培养。一般将

传代培养的累积次数作为传代细胞的代

数。三、器材¨

超净工作台¨

二氧化碳培养箱¨

普通显微镜¨

倒置显微镜¨

酒精灯¨

吸管■培养瓶■烧杯■离心管■离心机■镊子（圆头）■血球记数板四、试剂和材料¨

Hanks液¨

75％酒精¨

0.25％胰蛋白酶¨

DMEM培养液(含小牛血清及青、链霉素)五、操作¨

1、吸去或倾出旧的细胞培养液(对于小口的培养瓶可采用倾倒方法,对于培养皿,必须用吸管吸出)。¨

2、吸取适量的Hanks液加入培养瓶中,轻轻振荡后弃去，重复一次,以清除血清成分,利于胰酶消化。¨

3、加入适量0.25%胰蛋白酶（一般0.1～0.2mL/cm2，以消化液能覆盖整个瓶底为准）转动培养瓶，使其湿润整个细胞层，37℃下消化2-3分钟。翻转培养瓶,肉眼观察细胞单层，见细胞单层薄膜出现针孔大小空隙时即可吸除消化液(细胞的解离程度也可以通过倒置显微镜直接观察判断，一般以细胞突起缩回，细胞之间间隙增大，细胞缩成圆形等为准)。如消化程度不够，可延长消化时间；如见大量细胞片状脱落，表明已消化过头，则不能吸除消化液而直接进行下一步操作。¨

4、加入适量培养液终止消化¨

5、吸取瓶中培养液反复吹打瓶皿底壁上的细胞层，至全部冲下，轻轻吹打，混匀，成细胞悬液，取样计数，调整细胞密度为5×104

/ml。15cm培养瓶培养时，吸取1ml

细胞悬液加到新培养瓶中，加入4ml培养液，盖好，置37℃孵箱中培养。¨

6、观察：细胞传代后，应每日对细胞进行

观察，注意是否污染及细胞贴壁和生长情况。六、注意事项¨

1、吹打过程需有序进行，即从一边开始到另一边结束，注意边角处。¨

2、吹打时动作不宜过猛。七、结果与讨论¨

1．利用倒置显微镜，绘制出传代细胞生长图。¨

2．讨论影响本次实验能否成功的主要因素实验八植物组织培养培养基的配制一、实验目的¨

掌握植物组织培养培养基的配制方法和操作二、实验原理¨

配制植物组织培养的培养基最方便的方法是预先配制不同组分(大量元素、微量元素、铁盐、有机物质、激素)的培养基母液，贮藏在冰箱，待配制培养基时取出，按比例稀释。¨

配制母液时为了减少工作量可以把几种药品配在同一母液中，但是应该注意各种化合物的组合以及加入的前后顺序，因为一些离子之间易发生沉4

4淀，如Ca2+和S0

2+，Ca2+、Mg2+和PO

3-

一起溶解后，会产生沉淀。一定要把每种试剂单独、充分溶解后再按次序放入母液中。三、器材¨

高压蒸汽灭菌锅¨

250ml三角瓶（4个/组）¨

牛皮纸¨

pH试纸（5.4-7.0）¨

牛皮筋¨

电子天平¨

试剂瓶¨

线绳¨

PH计¨

烧杯（50、100、500、1000

m1）四、试剂和材料¨

1N

盐酸¨

1N

NaOH¨

琼脂¨

蔗糖¨

其它药品见表MS培养基母液的配制¨

2,4-D五、操作1、MS培养基母液的配制：按照表（见讲义）中数据分别配制大量元素、微量元素、铁盐、有机物质的母液，并在4℃冰箱中保存。铁盐的配制：在装有800ml蒸馏水的烧杯中加入4粒

苛性钠，溶解后加入7.46g

Na2EDTA·2H2O，加热使其全部溶解，然后边搅拌边慢慢加入5.56gFeSO4·7H2O直至全部溶解，冷却后定容至1000ml，置于冰箱中备用。2、植物激素母液的配制：1mg/ml的2,4-D溶液：取100mg的2,4-D，加入少量95%的酒精和1

N的NaOH溶解，再加蒸馏水定容至100ml。3、MS基本培养基的配制：分别吸取MS贮备液：50.0ml大量元素、5.0ml微量元素、5.0ml铁盐、5.0ml有机物质, 加入1L的搪瓷缸或烧杯中中，然后称取蔗糖30.0g, 加入琼脂8g，加蒸馏水约920ml，在电炉上加热，煮沸，融化琼脂，然后加水至950ml。（琼脂也可熬化后再加入）。4、含2mg/L

2,4-D

MS培养基的配制：吸取2,4-D母