植物生理与分子生物学：植物小分子RNA

植物小分子RNA/cgi/doi/10.1105/tpc.110.tt0210提纲小RNA概述siRNAmicroRNA实验室的相关工作什么是小RNA?小RNA是长度为21到24nt的RNA分子，通常参与基因的沉默（genesilencing）。小RNA通过影响mRNA的稳定性或翻译实现转录后的基因沉默（post-transcriptionalgenesilencing）。小RNA通过影响对染色质的表观修饰参与基因的转录水平沉默（transcriptionalgenesilencing）。AAAAARNAPol组蛋白修饰,DNA甲基化dsRNA:double-strandedRNA（双链RNA）

sRNA:smallRNA（小RNA）siRNA:shortinterferenceRNA（干扰RNA）miRNA:microRNA什么是小RNA?小RNA介导的基因沉默中的核心分子:

Dicers和

Argonautes由Dicer或Dicer-like

蛋白加工，成为短的RNAduplexes。这些小RNA与ARGONAUTE结合，导致基因沉默。DICERAGOSilencingDicerandDicer-like蛋白FromMacRae,I.J.,Zhou,K.,Li,F.,Repic,A.,Brooks,A.N.,Cande,W..,Adams,P.D.,andDoudna,J.A.(2006)Structuralbasisfordouble-strandedRNAprocessingbyDicer.Science311:195-198.ReprintedwithpermissionfromAAAS.Photocredit:Heidi在siRNA和miRNA加工过程中，Dicer或Dicer-like(DCL)蛋白将长链dsRNA或

foldback(hairpin)RNA切割成大约21–25nt的小片段。Argonaute蛋白ReprintedbypermissionfromMacmillanPublishersLtd:EMBOJ.Bohmert,K.,Camus,I.,Bellini,C.,Bouchez,D.,Caboche,M.,andBenning,C.(1998)AGO1definesanovellocusofArabidopsiscontrollingleafdevelopment.EMBOJ.17:170–180.Copyright1998;ReprintedfromSong,J.-J.,Smith,S.K.,Hannon,G.J.,andJoshua-Tor,L.(2004)CrystalstructureofArgonauteanditsimplicationsforRISCsliceractivity.Science305:1434–1437.withpermissionofAAAS.ARGONAUTE蛋白结合miRNA和靶基因mRNA。

ago1

船蛸ARGONAUTE蛋白是根据拟南芥argonaute1突变体命名的。小RNA介导的基因沉默－概论DCLAGOAGORNAPolAGOsiRNA介导的转录后和转录水平沉默。AAAnDCLMIRgeneRNAPolAGORNAPolmiRNA介导的mRNA剪切和翻译抑制。mRNAAGOAGOAAAnAAAnAAAnAAAnsiRNA的功能-植物抵抗病毒siRNA维持基因组稳定性：抑制入侵的病毒抑制异常的转录本沉默转座子和重复序列siRNA也参与了一些蛋白质编码基因的沉默。

ReprintedbypermissionfromMacmillanPublishers,Ltd:Nature.Lam,E.,Kato,N.,andLawton,M.(2001)Programmedcelldeath,mitochondriaandtheplanthypersensitiveresponse.Nature411:848-853.Copyright2001.病毒诱导的基因沉默AGO植物RNA病毒通常通过双链

RNA的形式来复制。DCL病毒ssRNA病毒dsRNA病毒编码的RNA-dependentRNApolymeraseAGO病毒双链RNA被DCL加工，产生siRNA，并进而在AGO的参与下沉默。植物可以在病毒接种后获得系统性抗性幼嫩的叶片并没有出现病毒感染的症状，说明它们获得了抗性。成熟幼嫩接种病毒植物可以在病毒接种后获得系统性抗性再次接种病毒，但是幼嫩的叶片并没有出现病毒感染的症状。成熟幼嫩接种病毒对病毒的抗性是siRNA介导的第１天

–接种病毒或水第22天–接种病毒或水到幼嫩的叶片上第32天–提取RNA，分析病毒RNA的水平。第１天第22天病毒水水病毒病毒病毒接种病毒后，会产生一个移动的信号，阻遏病毒的复制。接种FromRatcliff,F.,Henderson,B.D.,andBaulcombe,D.C.(1997)Asimilaritybetweenviraldefenseandgenesilencinginplants.Science276:1558–1560.ReprintedwithpermissionfromAAAS.第32天小RNA参与了系统性病毒抗性接种病毒后，植物会产生针对该病毒的小RNA。这些小RNA会移动到幼嫩的叶片中，导致这些叶片获得抗性。接种的叶片系统获得性叶片接种后的天数Hamilton,A.J.,andBaulcombe,D.C.(1999).AspeciesofsmallantisenseRNAinposttranscriptionalgenesilencinginplants.Science286:950–952.接种的叶片系统获得性叶片DCL接种的叶片幼嫩叶片AGO小RNA参与了系统性病毒抗性RNA沉默信号的移动在紫外灯下，转GFP植物的叶片呈绿色。GFP在紫外灯下，野生型植物的叶片的叶绿体会自发荧光，呈红色。ReprintedwithpermissionfromKalantidis,K.,Schumacher,H.T.,Alexiadis,T.,andHelm,J.M.(2008)RNAsilencingmovementinplants.

Biol.Cell100:13–26;(c)theBiochemicalSociety.RNA沉默信号的扩散人为构建了针对GFP的双链RNA。GFPGFPReprintedwithpermissionfromKalantidis,K.,Schumacher,H.T.,Alexiadis,T.,andHelm,J.M.(2008)RNAsilencingmovementinplants.

Biol.Cell100:13–26;(c)theBiochemicalSociety.GFP：绿色荧光蛋白RNA沉默信号的扩散当GFP沉默后，红色本底自发荧光显现。GFPGFPReprintedwithpermissionfromKalantidis,K.,Schumacher,H.T.,Alexiadis,T.,andHelm,J.M.(2008)RNAsilencingmovementinplants.

Biol.Cell100:13–26;(c)theBiochemicalSociety.沉默可以在局部扩散通常可以看到沉默信号会扩散15个细胞。其扩散的通道可能就是胞间连丝。ReprintedwithpermissionfromKalantidis,K.,Schumacher,H.T.,Alexiadis,T.,andHelm,J.M.(2008)RNAsilencingmovementinplants.

Biol.Cell100:13–26;(c)theBiochemicalSociety.通过筛管移动造成的系统性沉默ReprintedbypermissionfromMacmillanPublishers,Ltd:NatureCopyright1997.Voinnet,O.,andBaulcombe,D.(1997)Systemicsilencingingenesilencing.Nature389:553.初始注射的叶片系统性沉默系统性沉默信号的放大DCL次级siRNARdRPDCL初生siRNA次级siRNA的产生需要初生siRNA和RNA-dependentRNApolymerase(RdRP).病毒的抵抗策略DCLRdRPDCL病毒会产生许多抑制子，这些抑制蛋白可以干扰植物产生初生和次生siRNA，从而保证病毒侵染的成功。Anandalakshmi,R.,Pruss,G.J.,Ge,X.,Marathe,R.,Mallory,A.C.,Smith,T.H.,andVance,V.B.(1998).Aviralsuppressorofgenesilencinginplants.Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:13079–13084.没有病毒抑制子突变的病毒抑制子病毒抑制子转录siRNAsiRNAsiRNA病毒抑制子病毒的抵抗策略转基因沉默转基因经常出现沉默现象。沉默产生的可能原因：

超高的表达转基因中存在dsRNA转基因中存在异常的RNA转基因沉默位于转录水平和转录后水平。转基因引起的基因沉默Photocredits:MarthaHawes,UniversityofArizona.80年代,科学家发现可以利用农杆菌将外源DNA导入植物细胞，并整合入基因组中。植物细胞细胞核DNA植物细胞表面的农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）矮牵牛花色的形成野生型矮牵牛产生紫色的花色素苷。查尔酮合成酶（Chalconesynthase，CHS）是花色素苷合成途径上的关键基因。PhotocreditRichardJorgensen;Aksamit-Stachurskaetal.(2008)BMCBiotechnology8:25.

花色素苷查尔酮合成酶通过转基因过量表达基因产物过量的mRNA过量表达载体启动子编码基因内源基因mRNA转基因mRNA蛋白表达mRNAmRNA过量蛋白表达编码基因强启动子反义RNA反义载体转基因正反义双链形成，抑制翻译通过反义RNA抑制基因表达过量的mRNA过量表达载体启动子编码基因内源基因mRNA转基因mRNA蛋白表达mRNAmRNA过量蛋白表达PhotocreditRichardJorgensen转基因植物过量表达CHSCHS正义或过量表达和反义抑制均造成基因下调过量表达反义野生型共抑制现象Napoli,C.,Lemieux,C.,andJorgensen,R.(1990)Introductionofachimericchalconesynthasegeneintopetuniaresultsinreversibleco-suppressionofhomologousgenesintrans.PlantCell2:279–289.转基因mRNA内源mRNA紫色花白色花在转基因过程中出现的内源和外源基因同时沉默的现象称为“共抑制”。共抑制现象是由于siRNA的产生造成的DePaoli,E.,Dorantes-Acosta,A.,Zhai,J.,Accerbi,M.,Jeong,D.-H.,Park,S.,Meyers,B.C.,Jorgensen,R.A.,andGreen,P.J.(2009).DistinctextremelyabundantsiRNAsassociatedwithcosuppressioninpetunia.RNA15:1965–1970.启动子编码基因野生型mRNAmRNA蛋白表达内源基因正义mRNA正义载体共抑制转基因共抑制启动子编码基因内源基因mRNAsiRNAproducedAGOAGOAAAnAGOAAAn总结siRNA通过基因沉默的方式干扰病毒的复制。siRNA是系统性信号，可以通过维管束移动，帮助植物抵抗病毒。大多数病毒会产生抑制蛋白抑制植物siRNA防御途径。转基因过程中出现的共抑制现象是由siRNA介导的。microRNA-miRNAmiRNA的加工类似于siRNA，可能由siRNA进化而来。植物体内有少量的保守的miRNA和大部分非保守的miRNA。miRNA由特异基因编码，是反式作用因子。miRNA参与和调控了植物的生长发育和许多生理学过程。microRNA-miRNADCLMIRgeneRNAPolAGORNAPolmRNAAGOAGOAAAnAAAnAAAnAAAnmiRNA可以剪切mRNA或抑制翻译。miRNA和siRNA是由不同的DCL加工的ReprintedfromMargis,R.,Fusaro,A.F.,Smith,N.A.,Curtin,S.J.,Watson,J.M.,Finnegan,E.J.,andWaterhouse,P.M.(2006)TheevolutionanddiversificationofDicersinplantsFEBSLett.580:2442-2450withpermissionfromElsevier.拟南芥中有4个DCL蛋白，它们的多样性提高了植物的防御性。DCL1加工产生

miRNADCL2-4加工产生

siRNADCL4DCL1miRNA和siRNA结合不同的AGO蛋白AGO1AGO4AGO1偏好剪切靶基因mRNA，它与miRNA结合。拟南芥中，共有10个AGO蛋白。它们在功能上是不同的。ReprintedfromVaucheret,H.(2008)PlantARGONAUTES.TrendsPlantSci.13:350-358withpermissionfromElsevier.AGO4

偏好与siRNA结合，参与DNA的甲基化。MIR

基因的转录和加工

miRNA是由MIR基因编码。初始转录本（pri-MIRNA）形成茎环结构，被DCL1加工成双链小RNA。

通常miRNA*被降解。DCL3'5'miRNAmiRNA*3'5'pri-miRNAmiRNAMIR

基因靶标mRNA保守与非保守的miRNAFahlgren,N.,Howell,M.D.,Kasschau,K.D.,Chapman,E.J.,Sullivan,C.M.,Cumbie,J.S.,Givan,S.A.,Law,T.F.,Grant,S.R.,Dangl,J.L.,andCarrington,J.C.(2007)High-throughputsequencingofArabidopsismicroRNAs:EvidenceforfrequentbirthanddeathofMIRNAgenes.PLoSONE.2007;2(2):e219.在保守的miRNA中，大约有一半的miRNA靶标转录因子。FactorsFactorsFahlgren,N.,Howell,M.D.,Kasschau,K.D.,Chapman,E.J.,Sullivan,C.M.,Cumbie,J.S.,Givan,S.A.,Law,T.F.,Grant,S.R.,Dangl,J.L.,andCarrington,J.C.(2007)High-throughputsequencingofArabidopsismicroRNAs:EvidenceforfrequentbirthanddeathofMIRNAgenes.PLoSONE.2007;2(2):e219.非保守的MIRNA

家族通常只有一个拷贝。保守的MIRNA

家族通常成为一个基因家族。Factors保守与非保守的miRNA在保守的miRNA中，大约有一半的miRNA靶标转录因子。miRNA的命名规则miR1miR2....miR156miR157....miR173..第一批植物miRNA被鉴定编号按照发现顺序，包括所有生物一些MIR

在所有植物中都存在Cuperus,J.T.,Fahlgren,N.,andCarrington,J.C.(2011).EvolutionandFunctionalDiversificationofMIRNAGenes.PlantCell:tpc.110.082784.在所有植物中保守在被子植物中保守MIR156基因家族是高度保守的ReprintedfromReinhart,B.J.,Weinstein,E.G.,Rhoades,M.W.,Bartel,B.,andBartel,D.P.(2002)MicroRNAsinplants.GenesDev.16:1616–1626.

miR156在被子植物和苔藓中均存在。

miR156在拟南芥中有8个编码基因。一些保守miRNA的靶基因miRNA基因家族靶基因家族靶基因功能156/7SPLtranscriptionfactorsDevelopmentaltiming160ARFtranscriptionfactorsAuxinresponse,development165/6HD-ZIPIIItranscriptionfactorsDevelopment,polarity172AP2transcriptionfactorsDevelopmentaltiming,floralorganidentity390TAS3(tasiRNA)whichactsonARFtranscriptionfactorsAuxinresponse,development395SulfatetransporterSulfateuptake399ProteinubiquitinationPhosphateuptakeAdaptedfromWillmann,M.R.,andPoethig,R.S.(2007)ConservationandevolutionofmiRNAregulatoryprogramsinplantdevelopment.Curr.Opin.PlantBiol.10:503–511..miRNA产生的进化理论ReprintedfromWillmann,M.R.,andPoethig,R.S.(2007)ConservationandevolutionofmiRNAregulatoryprogramsinplantdevelopment.Curr.Opin.PlantBiol.10:503–511withpermissionfromElsevier.基因复制植物miRNA可能是通过靶基因的反向重复，并经历长时间的选择变异产生的。miRNA调控下游基因表达miRNA调控下游基因表达的特异性蓝色：非靶基因绿色：靶基因miRNA参与植物形态建成miRNA分布特征可以在时间或空间上决定靶基因的活性。miRNA可以在细胞间移动，决定靶基因的浓度梯度。miRNA表达造成浓度梯度靶基因的活性低中高高

中低高

中

低miRNA移动造成浓度梯度。低中高茎尖顶端分生组织结构1cm5day7day10day叶原基50µm茎尖顶端分生组织结构phb-1d

突变野生型phb-1d针状叶phb-1d

突变影响了PHBmRNA的积累模式在野生型中，PHB

在叶片的近轴面表达。ReprintedbypermissionfromMacmillanPublishers,Ltd:NATURE.McConnell,J.R.,Emery,J.,Eshed,Y.,Bao,N.,Bowman,J.,andBarton,M.K.(2001)RoleofPHABULOSAandPHAVOLUTAindeterminingradialpatterninginshootsNature411:709-713,copyright2001.纵切横切扫描电镜在显性突变体phb-1d

中，PHB

在原基中广泛表达。叶片针状，近轴化。纵切横切ReprintedbypermissionfromMacmillanPublishers,Ltd:NATURE.McConnell,J.R.,Emery,J.,Eshed,Y.,Bao,N.,Bowman,J.,andBarton,M.K.(2001)RoleofPHABULOSAandPHAVOLUTAindeterminingradialpatterninginshootsNature411:709-713,copyright2001.在野生型中，PHB

在叶片的近轴面表达。phb-1d

突变影响了PHBmRNA的积累模式横切AAAAAAAAGO野生型植物中，miR166靶标PHB

的mRNA，导致其仅在叶片的近轴面表达。miR166PHBmRNAReprintedbypermissionfromMacmillanPublishers,Ltd:NATURE.Kidner,C.A.andMartienssen,R.A.(2004)SpatiallyrestrictedmicroRNAdirectsleafpolaritythroughARGONAUTE1.Nature428:81-84,copyright2004;McConnell,J.R.,Emery,J.,Eshed,Y.,Bao,N.,Bowman,J.,andBarton,M.K.Nature411:709-713,copyright2001.PHB受miR166调控AAAAAAA在phb-1d

突变体中，突变位点位于miR166识别位点。这些碱基的突变导致了PHB不能被miR166识别，因此PHB在整个原基中都有表达。xPHB-1DmRNAAAAAAAAAGOmiR166PHBmRNAReprintedbypermissionfromMacmillanPublishers,Ltd:NATURE.Kidner,C.A.andMartienssen,R.A.(2004)SpatiallyrestrictedmicroRNAdirectsleafpolaritythroughARGONAUTE1.Nature428:81-84,copyright2004;McConnell,J.R.,Emery,J.,Eshed,Y.,Bao,N.,Bowman,J.,andBarton,M.K.Nature411:709-713,copyright2001.野生型植物中，miR166靶标PHB

的mRNA，导致其仅在叶片的近轴面表达。PHB受miR166调控miRNA和营养信号传递植物从土壤中吸收营养。地上部分会传递营养吸收信号到根部。营养转运营养吸收©HeidiNaturaoftheConservationResearchInstitute.miR399感受磷信号Bari,R.,Pant,B.D.,Stitt,M.andScheible,W.-R.(2006)PHO2,microRNA399,andPHR1defineaphosphate-signalingpathwayinplants.PlantPhysiol.141:988–999;Chiou,T.J.,Aung,K.,Lin,S.I.,Wu,C.C.,Chiang,S.F.andSu,C.L.(2006)RegulationofphosphatehomeostasisbymicroRNAinArabidopsis.PlantCell18:412–421.miR399编码基因受到磷缺乏的诱导。过量表达miR399导致磷的大量积累。Ubiquitin-conjugatingE2是

miR399的靶标

E2的基因结构miR399识别位点当miR399含量提高时，E2的表达下降。E2功能丧失导致磷的过量积累。

miR399 E2磷的吸收Chiou,T.J.,Aung,K.,Lin,S.I.,Wu,C.C.,Chiang,S.F.andSu,C.L.(2006)RegulationofphosphatehomeostasisbymicroRNAinArabidopsis.PlantCell18:412–421.E2是泛素化降解途径中的一员AdaptedfromVierstra,R.D.(2009)Theubiquitin–26Sproteasomesystematthenexusofplantbiology.Nat.Rev.Mol.CellBiol.10:385-397.CUL1SKP1F-boxSCFE3complex26Sproteosome靶标UbiquitinE2E2仅在根中发挥功能Bari,R.,Pant,B.D.,Stitt,M.andScheible,W.-R.(2006)PHO2,microRNA399,andPHR1defineaphosphate-signalingpathwayinplants.PlantPhysiol.141:988–999磷只在根为pho2的植物中积累基因型过量表达miR399促进磷吸收Pant,B.D.,Buhtz,A.,Kehr,J.,Scheible,W.-R.(2008)MicroRNA399isalong-distancesignalfortheregulationofplantphosphatehomeostasis.PlantJ.53:731-738.为什么在地上部分高表达miR399会导致根部磷吸收的增加?

miR399overexpressioninshoot+rootshootonlyrootonlymiR399从茎向下运输Pant,B.D.,Buhtz,A.,Kehr,J.,Scheible,W.-R.(2008)MicroRNA399isalong-distancesignalfortheregulationofplantphosphatehomeostasis.PlantJ.53:731-738.miR399levelsinshootmiR399在根中过量表达，在茎中并没有检测到miR399含量的上升。miR399levelsinrootmiR399在茎中过量表达，在根中可以检测到miR399含量的上升。miR399是一个在筛管中的移动信号磷的吸收加强miR399靶蛋白降解磷充足的情况下磷缺乏情况下E2水平降低，

蛋白降解降低，靶蛋白升高PHO2miR399miR399

GUCCCGUUUAGAGGAAACCGU

PHO2

UUGGGCAAAUCUCCUUUGGCAmiR399与其靶基因

PHO2的mRNA高度匹配miR399活性受到模拟靶标

（targetmimic）的调控miR399活性受到模拟靶标

（targetmimic）的调控RedrawnfromFranco-Zorrilla,J.M.,Valli,A.,Todesco,M.,Mateos,I.,Puga,M.I.,Rubio-Somoza,I.,Leyva,A.,Weigel,D.,García,J.A.,andPaz-Ares,J.(2007)TargetmimicryprovidesanewmechanismforregulationofmicroRNAactivity.Nat.Genet.39:1033–1037.PHO2miR399miR399

GUCCCGUUUAGAGGAAACCGUPHO2

UUGGGCAAAUCUCCUUUGGCAmiR399miR399

GUCCCGUUGAGAGGAAACCGU

5’IPS1

UUGGGCAACUUUCCUUUGGCA

CUA

IPS1

结合

miR399，但是在剪切位点处多出几个碱基，因此是一个不能被剪切的靶基因IPS1IPS1抑制miR399活性PHO2miR399miR399没有IPS1miR399靶标PHO2；PHO2蛋白水平低；磷吸收低。IPS1

存在时PHO2miR399活性被抑制；

PHO2积累；磷吸收增加。海绵机制人工miRNA替换茎环区的序列人工miRNAmiRNA总结

Stem-loop结构，由DCL1加工，AGO1负责其行使功能；植物中有许多保守的miRNA，它们的功能非常重要；植物的miRNA表达具有时空性；植物miRNA可以移动；靶基因模拟和人工miRNA是调控miRNA活性的一个重要手段。tasiRNADICERTAS

基因RNAPolIIAGORDR61.TAS

基因由

RNAPolII转录2.转录本被miRNA靶标并剪切3.由RDR6辅助，形成dsRNA

tasiRNA–trans-actingsiRNA由TAS基因编码miRNA诱发其初始转录本的加工tasiRNA的加工机制DICER4.dsRNA经由

DCL4加工形成

许多tasiRNAs拟南芥有四个TAS

基因。TAS1和TAS2的tasiRNAs靶标pentatricopeptiderepeatgenes；TAS3

的tasiRNAs靶标ARFtranscriptionfactors；TAS4

的tasiRNAs靶标MYBtranscriptionfactors。tasiRNA的同步性ReprintedfromAllen,E.,Xie,Z.,Gustafson,AM.,andCarrington,J.C.(2005)microRNA-directedphasingduringtrans-actingsiRNAbiogenesisinplants.Cell121:207-221,withpermissionfromElsevier.初始剪切位点DCL4在dsRNA上移动，测量，然后剪切nat-siRNAsRedrawnfromKatiyar-Agarwal,S.,Morgan,R.,Dahlbeck,D.,Borsani,O.,VillegasJr.A.,Zhu,J.-K.,Staskawicz,B.J.,andJin,H.(2006)

Apathogen-inducibleendogenoussiRNAinplantimmunity.Proc.Natl.Acad.Sci.USA103:18002–18007.Nat-siRNAs–Naturalcis-actingsiRNAsAGOAGO反向重叠基因互补的两条mRNA产生dsRNA基因沉默miRNA的生物学功能-miR156种子萌发合子幼年期营养生长期转变年龄：随着时间而出现的改变。形态上代谢上环境适应性上成年期生殖生长期胚胎期开花年龄的分子身份是什么?

什么内源因素导致了年龄的不可逆性?年龄是如何调控植物生长发育的?幼年期和成年期植物的差异PhotoscourtesyofJamesMauseth成年期幼年期拟南芥中幼年期向成年期的转变幼年期的叶片：圆型，边缘光滑；叶下表皮无毛；成年期的叶片：梭型，边缘有齿状缺刻；叶下表皮有毛；ReprintedfromPoethig,R.S.(2009)SmallRNAsand