电泳原因分析

的DNA的DNA模板消除。建议可将第一链 cDNA稀释1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染所造成的影响。*有可能是引物二聚体的条带1.cDNA产量的很低可能的原因：*RNA模板质量低*对mRNA浓度估计过高*反应体系中存在反转录酶抑制剂或反转录酶量不足*同位素磷32过期*反应体积过大，不应超过50口12.扩增产物在电泳分析时没有条带或条带很浅*最常见的原因在于您的反应体系是 PCR的反应体系而不是RT-PCR的反应体系*与反应起始时RNA的总量及纯度有关*建议在试验中加入对照RNA*第一链的反应产物在进行 PCR扩增时，在总的反应体系中的含量不要超过 1/10*建议用Oligo(dT)或随机引物代替基因特异性引物(GSP)用于第一链合成。由于RNA模板存在二级结构，如环状结果，有可能导致 gsp无法与模板退火；或ssn反转录酶无法从此引物进行有效延伸。*目的mRNA中含有强的转录中止位点，可以试用以下方法解决：将第一链的反应温度提高至 50C。使用随机六聚体代替 Oligo(dT)进行第一链反应。产生非特异性条带*用RT阴性对照检测是否被基因组 DNA污染。如果RT阴性对照的PCR结果也显示同样条带，则需要用DNaseI重新处理样品。*在PCR反应中，非特异的起始扩增将导致产生非特异性结果。 在低于引物Tm2至5C的温度下进行退火，降低镁离子或是目的 DNA的量将减少非特异性结果的产生。*由于mRNA剪切方式的不同，根据选择引物的不同将导致产生不同的 RT-PCR结果。产生弥散(smear)条带*在PCR反应体系中第一链产物的含量过高*减少引物的用量*优化PCR反应条件/减少PCR的循环次数*在用DNase处理被DNA污染的RNA样品时，其产生的寡核苷酸片段会产生非特异性扩增，一般会显示为弥散背景。产生大分子量的弥散条带*大多数情况下是由于退火温度过低而导致的非特异性的起始及延伸产生的*对于长片段的PCR，建议将反应体系中cDNA的浓度稀释至1:10(或1:100-1:200)在无反转录酶的情况下，对照 RNA获得扩增结果*通常是由于对照RNA中含有痕量DNA而导致的。由于进行体外转录时不可能将所有扩增产物滞留在加样孔中*有可能是由于模板量过高而导致 PCR结果产生了高分子量的DNA胶状物。建议将第一链结果至少稀释100倍再进行二次扩增。*另外，在二次PCR时使用的退火温度如果比引物的 Tm值低5C,可以将退火温度适当增高或进行热启动以提高特异性。ss川与ssn有何不同？*具有更高的热稳定性（达50C）*具有更长的半衰期（达 220分钟）*对PCR无抑制*干冰运输*Tdt活性更低为什么有人更喜欢用SSH而不是ThermoScript?ThermoScript如果保存不当会引起活性很快降低， SS川则更稳定。10.为什么使用基因特异性引物（ GSP）?GSP在扩增低丰度的转录本时是最好的。 OligodT引物建议用于高质量RNA及全长转录本的逆转录；随机引物用于 mRNA片段的逆转录。什么情况下需要使用RNaseH?目的建议RT与PCR使用不同的引物或需要灵活选择PCRDNA目的建议RT与PCR使用不同的引物或需要灵活选择PCRDNA聚合酶两步法RT-PCR系统咼灵敏度一步法或两步法RT-PCR系统根据不同的目的选择不同的系统：高特异性含有适当的DNA聚合酶的两步法RT-PCR系统或具有高保真PlatinumTaq酶的一步法RT-PCR系统高保真度含有PfxTaq酶的两步法RT-PCR系统长的反转录结果通常使用两步法RT-PCR系统可达到最佳结果含Elongase酶的一步法RT-PCR系统二、Generacer1.如何针对Generacer试剂盒设计基因特异性引物（ GSP）?使用5或3'RACE试剂都需要至少一条基因特异性引物，您在设计引物时需要注意以下几点要求：*50-70%的GC含量，以提高引物熔点（Tm）*23-28个碱基长度，以提高引物特异性*降低3端GC含量，将引物非特异性结合的可能性降至最低2.为什么得不到RACE产物？*加入Hela对照

*低质量的RNA模板*逆转录失败，SSII和SSIII非常适用于长模板cDNA的合成*目的基因丰度太低，可以通过提高 PCR的循环次数来解决，建议使用巢式PCR*目的基因没有表达，可以通过使用两条 GSPs来分析cDNA中是否含有目的基因*目的基因太长而不适合进行反转录， 建议使用GeneRacer试剂盒中的OligodT来得到全长cDNA，使用随机引物或与模板的 5'端尽可能近的GSP进行PCR。*cDNA模板属于困难模板，可以通过以下方法解决：优化 PCR反应参数及反应体系；降低退火温度；使用5-10%的DMSO帮助通过高GC含量区；使用高保真度和高延伸能力的酶进行PCR反应。3.RACE的PCR结果有杂带RACEPCR杂带或非特异性PCR条带可能是由于以下原因：*GSP与其他cDNA的非特异性结合会导致在扩增目的产物时得到无关产物。*GeneRacer引物和cDNA的非特异性结合会导致产生一端带有 GeneRacer引物序列的PCR产物。*RNA降解。*PCR管或试剂污染。注意：杂带一般是因为没有优化 PCR条件，可以加入阴性对照来确定。4.得不到全长的5'RACEPCR产物*CIP反应后的RNA降解产生了新的带有5'磷酸的断裂模板，可以同 GeneRacerRNAOligo连接。一疋要小心操作，保证 RNA无降解。*CIP脱磷酸不完全，可以增加反应中 CIP的量或减少RNA的量。*PCR产生了杂带，并不是真正的连接产物，可以使用上述建议优化 PCR。二、Generacer1.如何针对Generacer试剂盒设计基因特异性引物（ GSP）?使用5或3'RACE试剂都需要至少一条基因特异性引物，您在设计引物时需要注意以下几点要求：*50-70%的GC含量，以提高引物熔点（ Tm）*23-28个碱基长度，以提高引物特异性*降低3端GC含量，将引物非特异性结合的可能性降至最低2.为什么得不到RACE产物？*加入Hela对照*低质量的RNA模板*逆转录失败，SSII和SSIII非常适用于长模板cDNA的合成*目的基因丰度太低，可以通过提高 PCR的循环次数来解决，建议使用巢式 PCR*目的基因没有表达，可以通过使用两条 GSPs来分析cDNA中是否含有目的基因*目的基因太长而不适合进行反转录， 建议使用GeneRacer试剂盒中的OligodT来得到全长cDNA，使用随机引物或与模板的 5'端尽可能近的GSP进行PCR。*cDNA模板属于困难模板，可以通过以下方法解决：优化 PCR反应参数及反应体系；降低退火温度；使用5-10%的DMSO帮助通过高GC含量区；使用高保真度和高延伸能力的酶进行PCR反应。

3.RACE的PCR结果有杂带RACEPCR杂带或非特异性PCR条带可能是由于以下原因：*GSP与其他cDNA的非特异性结合会导致在扩增目的产物时得到无关产物。*GeneRacer引物和cDNA的非特异性结合会导致产生一端带有 GeneRacer引物序列的PCR产物。*RNA降解。*PCR管或试剂污染。注意：杂带一般是因为没有优化 PCR条件，可以加入阴性对照来确定。4.得不到全长的5'RACEPCR产物*CIP反应后的RNA降解产生了新的带有5'磷酸的断裂模板，可以同GeneRacerRNAOligo连接。一疋要小心操作，保证RNA无降解。*CIP脱磷酸不完全，可以增加反应中CIP的量或减少RNA的量。*PCR产生了杂带，并不是真正的连接产物，可以使用上述建议优化PCR。三、 PCR在进行PCR时：*请确保您没有使用过量的起始 DNA或者过高浓度的引物，也没有加入过量的 Mg++*请确保您使用了恰当的退火温度*请确保您没有使用过量的DNA聚合酶四、 引物1.应该选择哪种纯化方法？取决于实验目的和引物的长度2.为什么我订购了50nmol,但是收到却只有40nmol?50nmol是起始量3.怎样制备1001M的储液？体积（（1）=质检报告上的nmol数目X104.怎样设计引物？*一般长度20-30bp；*至少50%的GC含量；*避免引物二聚体和二级结构；*引物对的Tm值应该接近。5.引物序列有插入或缺失？*使用上游和下游引物多测几个克隆。*请选择正确的纯化方法。6.PCR无结果？*请检查引物设计是否正确；*请检测0D读数是否正确；*做一个阳性对照和一个阴性对照

问题可能原因建议解决方法RT-PCF灵敏RNA被降解在用来验证完整性之前先在变性胶上分析 RNA度：在琼脂使用良好的无污染技术分离 RNA糖凝胶分析在将组织从动物体取出后立刻处理中看到少量在100%甲酰胺中储存RNA如果使用胎盘RNase抑制剂，不要或没有RT-P加热超过45C或pH超过8.0，否则抑制剂或释放所有结合的CR产物RNasa而且，在》0.8mMDTT时加入RNase抑制剂，一定要存在DTT。RNA中包含通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70%(v/v)乙醇对RNA沉逆转录抑制淀进行清洗。可以加入糖兀(0.25卩g到0.4卩g/卩l)以帮助剂小量样品RNA的恢复。逆转录抑制剂包括：SDSEDTA甘油，焦磷酸钠，亚精胺，甲酰胺和胍盐。将对照RNA同样品混合，冋对照RNA反应比较产量以检验抑制剂。多糖同RNA共沉淀使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。用于合成CD确定退火温度适合您的引物。 对于随机六聚体，建议在反应温NA第一链合度保温之前先在25C保温10分钟。成的引物没对于基因特异性引物(GSP，可以试一下其他GSP或换用o有很好退火igo(dT)或随机六聚体确定GSP是反义序列。起始RNA量增加RNA量。不够对于v50ng的RNA样品，可以在第一链cDNA合成中使用0.1卩g到0.5卩g乙酰BSARNA莫板二将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性 /退火级结构太多提咼逆转录反应温度，对 SuperScriptn可以到50C，对ThermoScript可以到65C。注意：不要在〉60C时使用oligo(dT)引物，选择一个在反应温度可以退火的GSP对于〉1kb的RT-PCR产物，保持反应温度w65C。注意：不要在咼于37C时使用M-MLV如果不需要全长cDNA在第一链反应中使用随机引物。引物或模板对残余的RNA模板敏感在PCR前用RNaseH处理。靶序列在分尝试其他靶序列或组织析的组织中

不表达PCR没有起作用对两步法RT-PCR不要在PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物PCR灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物PCR引物设计较差避免在引物3'端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。DNA含有抑制剂诸如DMSOSDS和甲酰胺之类的试剂会抑制 TaqDNA聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂，可以使用乙醇沉淀 DNA富含GC的模板对于GC含量〉50%的模板，使用PCRxEnhancerSolution 。模板浓度太低使用10A4拷贝的靶序列，以在25到30个循环中获得信号。镁离子浓度太低从1mM到3mM间隔0.5mM进行一系列反应，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。注意：对实时定量 PCR使用3mM到5mM的镁离子浓度。退火温度太高使用表4的公式估算Tm把退火温度设定为低于Tm5C。因为这些公式只是估算Tm值，所有真正的退火温度实际会高些或低些。PCR灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物引物浓度太低最佳引物浓度介于0.1卩M到0.5卩M之间。为了精确确定引物浓度，在260nm测量光密度，然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。(见公式1,2)RT-PCR特异性：在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带引物和模板非特异性退火在第一链合成中使用GSP而不是随机引物或oligo(dT)。试用允许高温cDNA合成的GSPGSP设计较差遵循用于扩增引物设计的冋样原则RNA中沾染了基因组DNA使用扩增级DNaseI处理RNA使用没有逆转录的对照反应检测DNA污染。形成引物二聚体设计在3'端没有互补序列的引物。引物和模板非特异性退火以2C到5C间隔增加退火温度，减少退火时间。在开始几个循环使用较高的退火温度， 然后使用较低的退火温度。使用PlatinumTaqDNA进行自动热启动PCR

避免在引物3'端含有2到3个dG或dCo镁离子浓度太高对于每一个模板和引物组合优化镁离子浓度。因为扩增复杂模板导致引物错误起始使用巢式PCR或递减PCR沾染外源DNA使用抗气雾剂的吸头和UDG（见第八章）。因为二级结构导致引物纟吉合位点无法接近对于GC含量〉50%的模板，使用(1X-3X)PCRxEnhancerSolution。PCR忠实性：PCR在产物序列中引入了错误聚合酶忠实性低使用带有校正活性的热稳定聚合酶，如 PlatinumPfxDNA聚合酶。循环数太多降低循环数。四种dNTP的