临床检验遗传学：第十四章 DNA蛋白质测序仪

第十四章DNA/蛋白质测序仪•45岁，女性，乳腺癌，双侧•ER,PR阴性•HER-2阴性如何确定BRCA基因上的碱基排列？•确诊为HOBC•对亲属进行相关的风险评估CONTENTS01背景02DNA测序仪及其应用03蛋白质测序及其应用目录staticdynamicCONTENTS01DNA测序仪及其应用02蛋白质测序及其应用目录DNA测序的发展历程DNA测序用于确定目标DNA上片断上的碱基排列顺序；DNA测序是分子生物学过程一项非常重要的内容，在疾病诊断、基础研究的过程中起着非常重要的作用；人类基因组计划(HumanGenomeProject,HGP)完成后，测序技术已经成为现代医学的基础。第一代测序以化学降解法和末端终止法，具有片段长，准确性高的优点，代表公司ABI，贝克曼第二代测序目前应用广泛，通量高，代表公司Illumina以及ThermoFisher第三代测序以纳米孔单分子测序技术为代表，无需要PCR第一代测序一、第一代测序技术测序

Sanger双脱氧链末端终止法Maxam-Gilber化学降解法优点：操作简单、安全、快速、准确OOO5’3’HO5’3’OH无3’OH的ddNTP阻止下一个dNTP的掺入ATACG退火延伸/终止变性DNA模板引物测序酶ddNTPdNTPsddNTP被加到正在合成的链上，由于它的3’-OH已被氧化，下一个dNTP的5’-磷酸基团不能与之形成磷酸二酯键，使合成终止测序反应的延伸阶段，ddNTP在不同位置掺入产生一系列不同长度的新的DNA片段二、第一代测序技术检测方法1电泳法2放射自显影3荧光标记法三、荧光标记测序法荧光染料标记法单色荧光标记法多色荧光标记法荧光标记引物法荧光标记终止底物法

荧光标记引物法荧光标记终止底物法

三、荧光标记测序法ATACG退火延伸/终止变性DNA模板引物测序酶荧光标记的ddNTPdNTPs四、荧光标记底物法测序法确定一条染色体片断上的碱基顺序，是金标准。Sanger法：在PCR时加入荧光标记的复制终止剂，比如ddA,ddT,ddC,ddG（相应于4种碱基）ddX的两个作用：可以当作正常碱基参与复制一旦链入DNA中，其后就不能再继续连接毛细管电泳谁终止，碱基就是谁一种PCR技术PCR后产物的检测仪器全自动DNA测序仪平板型电泳的凝胶灌制在两块玻璃板中间，聚合后厚度一般小于0.4mm或更少，因此又称为超薄片层凝胶电泳毛细管电泳技术将凝胶高分子聚合物灌制于毛细管中（内径50

m～100

m），在高压及较低浓度胶的条件下实现DNA片段的快速分离主流五、荧光标记底物自动测序仪31031303130xl35003500xl37303730x机分析软件计算机耗材六、自动测序仪的结构AnodeBuffer(+)Pumpassembly(-)检测区凝胶区块自动进样器高压电源CCD

相机记录所有通道信号激光激发所有通道计算机分析测序数据激光源毛细管电泳方向七、自动测序仪的结果八、毛细管电泳型DNA测序仪的常见故障及维护电泳时仪器显示无电流

电泳缓冲液蒸发使液面降低，而未能接触到毛细管电极弯曲而无法浸入缓冲液中毛细管未浸入缓冲液中毛细管内有气泡等

电极弯曲

安装、调整或清洗电极后未进行电极定标操作就直接执行电泳命令，电极不能准确插入各管中运行前未将样品盘归位、或虽然执行了归位操作，但X/Y轴归位尚未结束就运行Z轴归位等电泳时产生电弧主要原因是电极、加热板或自动进样器上有灰尘沉积

其他

测序结束后应将毛细管负极端浸在蒸馏水中，避免凝胶干燥而阻塞毛细管定期清洗泵块定期更换电极缓冲液、洗涤液和废液管

电泳时仪器显示无电流

电泳缓冲液配制不正确电极导线未接好或损坏正极或负极铂金丝断裂正极或负极的胶面未浸入缓冲液中传热板粘住胶板主要原因为上方的缓冲液室漏液第二代测序之半导体测序法Multi-GeneWholeExomeWholeGenomeSingleGeneComplexitySangerSequencingNGSNGSNGS一、半导体测序法(IonTorrent测序)芯片上千万个DNA片段同时读取序列信息检测流程复杂的生物信息学分析第二代测序之边合成边终止法CAGTCATCACCTAGCGTA5’GTCAGTCAGTCAGT3’5’

第一个碱基结合Cycle1:

检测光信息切掉终止子和染料Cycle2-n:循环(Repeat)边合成边测序DNA

(0.1-1.0ug)

LibrarypreparationClustergeneration5’5’3’GTCAGTCAGTCACAGTCATCACCTAGCGTAGT123789456ImageacquisitionSequencingBasecallingT

G

C

T

A

C

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A

T…ACGTASCIICharacterQ-scorePF(0,1)SequenceInstrumentRunIDLaneTileX-coordY-coordIndex#Read#LibraryPreparation制备文库Sequencing测序

DataAnalysis数据分析43ClusterGeneration生成DNA簇21第三代测序-pacbio/huangshujia/p/3233693.html感染性疾病的分子诊断和研究遗传性疾病的分子诊断和研究恶性肿瘤的分子诊断和研究在分子生物学其他领域的应用CONTENTS01背景02DNA测序仪及其应用03蛋白质测序及其应用目录一、蛋白质自动测序仪蛋白质顺序指肽链中氨基酸的排列顺序通常从左至右表示肽链从氨基酸氨基端（N末端）到羧基端（C末端）蛋白质测序仪工作原理：执行全自动化的Edman化学降解反应和游离氨基酸的分离与鉴定过程

多肽链N末端NH2＋PITC弱碱苯异硫甲氨酰肽

TFA

噻唑啉酮苯胺（ATZ）衍生物＋剩余多肽

弱碱苯异硫甲氨酰肽

TFA

噻唑啉酮苯胺（ATZ）衍生物＋剩余多肽PTH氨基酸

PTH氨基酸

HPLC

HPLC

二、蛋白质测序仪的结构及其各部件的功能测序反应系统主要部件为反应器

氨基酸分析系统由高效液相色谱毛细管层析柱组成

信息软件处理系统根据氨基酸的层析峰来判断为何种氨基酸三、蛋白质测序仪的主要应用新蛋白质的鉴定在凝胶电泳中出现的未知条带可以利用