Talen技术及诱导多功能干细胞(iPS)在医学领域的发展应用

SIDANSAIBiotechnologyInnovatoronTALENtechnologyandStemCellresearchTalen技术及诱导多功能干细胞

在医学领域的发展应用俞加海斯丹赛生物技术有限公司靶向基因修饰经典难题：基因敲除（Knockout）什么是基因敲除：通过某种方法将一个特定靶基因破坏或失活，使其失去原有的功能。为什么要做基因敲除：基因敲除是寻找、证明基因功能过程中的必要步骤之一，是基因工程和基因治疗的重要手段。基因敲除的方法同源重组

(HomologousRecombination)依赖DNA分子的互补性，经典基因敲除方法特点：效率低（1per106cells），实验周期长

RNA干扰(RNAinterference),反义寡核苷酸(Morpholino)依赖RNA分子的互补性：高效性，特异性；特点：临时性，基因沉默而非敲除；锌指核糖核酸酶（ZFN）DNA识别域(ZFP)

+非特异性核酸内切酶构成（FokI)依赖DNA识别域的特异性：效率高但存在脱靶现象，专利被Sangamo垄断基因敲除的方法TALEdomain:DNA识别域TALE，植物病原体黄单胞菌Xantomonas–用于调控宿主基因由34的氨基酸长度的重复单位构成第12，13位点氨基酸（repeat-variabledi-residue，RVD）不同RVD决定识别位点不同Nucleasedomain:DNA剪切域FokI，发现于海床黄杆菌Flavobacteriumokeanokoites采取其非特异性DNA剪切结构域形成二聚体时发生剪切N’C’TALEFokILTPDAVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGNI→AHD→CNG→TNN→GA

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C新的里程碑技术：TALEN(transcriptionactivator-likeeffectornuclease)TALEN切割双链5’5’3’3’左臂右臂FokI聚合DSBDoublestrandBreakNon-homologousEndJoining(NHEJ)HomologousRecombination(HR)无模板有模板GeneDisruptionGeneinsertionGenereplacementTALEN的应用DNA水平的基因敲除DNA水平的定点插入DNA水平的单碱基修饰（点突变）建立基因敲除/敲入的真核细胞系建立基因敲除/敲入的真核生物模型应用I:基因敲除NatBiotechnol2013Jan;31(1):23-4TALEN的实际应用应用II：基因敲入NatureBiotechnology29，731-734（2011）TALEN的实际应用应用III:点突变TALEN的实际应用TALEN广泛应用BiotechnolBioeng.2013Mar18.doi:10.1002/bit.24890拟南芥短兵草牛蟋蟀果蝇仓鼠人青鳉小鼠线虫大鼠水稻蚕烟草酵母斑马鱼青蛙猪构建TALEN质粒如何将这些高度重复的DNA片段连接起来？TALEN的组装(GoldenGate)PCR3步Digest2步Ligate2步斯丹赛一步法只要4-5小时，这些片段就全部连接起来了一步连接123654913710121681411151718SoEASY！！SOFAST！！FastTALETM连接TALENN’C’N’C’TALENmodulesat9positionsTALENbackbonevectorsTALENassembledvectorsPromoterFokIPromoterFokIx4x16x4x16x4x16x4x16x4x16x4x16x16x16x4x16Position1Position2Position3Position4Position5Position6Position7Position8Position91/29x16dimers,7x4monomersCompletelibrary:172CMV,EF1a,Ubi,35S,T7,SP6MaximumRVDs:18.5MinimumRVDs:11.5多种TALEN骨架载体，满足不同物种需求第一组载体：干细胞专用打靶载体，采用EF1α启动子。第二组载体：构建动物模型专用载体，含有原核表达启动子sp6或T7，便于体外转录。第三组载体：普通细胞打靶载体，采用CMV启动子。第四组载体：植物专用打靶载体，采用ubiqutin或35s启动子。TALEN质粒构建流程靶点设计挑克隆细菌培养DNA质粒抽提酶切鉴定得到测序正确质粒TALEN连接细菌转化质粒测序鉴定Day1Day2Day3Day44天得到构建正确的TALEN质粒！简单、快速！靶点设计DecideTALENtarget(leftarm/rightarm)TALE-NT2.0/

DNASTAR/Target:12-19bpSpacer:12-21bp5‘

end‘0’position:mustbeT为了得到高活性质粒，建议设计2X3组合。TALEN连接1.设计序列，

选择模块2.加样，进行连接4-5h完成转化至感受态细胞在Kana+LB平板中培养细菌转化挑单克隆，细菌培养挑5-12个克隆（连接效率≈50%）Kana+LB培养液单克隆菌落将单菌落接入含5mlKa+的LB培养液的试管中DNA质粒抽提，酶切鉴定DNA质粒小抽提使用BamHI+PstI双酶切，植物载体采用BamHI+SpeItarget:16nttarget:19nt左臂右臂1kbMarker1kbMarkerDigestionDigestionAsssemblylength:15x102=1530Asssemblylength:18x102=1836Onbackbone:531Totallength:1530+531=2061Onbackbone:531Totallength:1836+531=23671个单模块（由34个氨基酸，即102个碱基组成）识别一个碱基上游引物305:5’-CTCCCCTTCAGCTGGACAC-3’下游引物306:5’-AGCTGGGCCACGATTGAC-3’S247引物：5’-GGGAGCACCCCTCAACCTGAC-3’质粒测序测序结果比对标准序列测序结果得到测序正确质粒305306测序正确质粒转染Mixcell抽提基因组、PCR测序并进行TA克隆打靶效率细胞单克隆获得稳定敲除细胞系药筛应用实例1细胞建系Hela细胞中XX基因敲除的稳转系建立：项目执行时长2个月设计TALEN识别序列；构建TALEN载体；测序验证质粒正确性实验流程：序列100%正确脂质体转染入Hela细胞中；puromycin药物筛选3天收集筛选后剩余的部分细胞，抽提基因组DNA,进行PCRPCR产物送测序比对测序结果，初步确认TALEN活性续上大于53%（每100个细胞中有53个细胞发生碱基突变）PCR产物TA克隆、单克隆测序确定打靶效率续上2023/10/9最终挑选出阳性单细胞克隆，扩增，保存，稳定遗传系建立成功消化细胞呈单细胞，接种于96孔板中，待单细胞克隆长大后，同上进行鉴定部分单细胞克隆测序结果：单克隆鉴定结果表明：基因改变类型包括插入和缺失两种形式，造成基因移码突变，成功构建稳转系。根据打靶效率，挑取一定数量单克隆进行测序。续上根据测序峰图，鉴定出双拷贝敲除的单克隆打靶效率经验参考建立knock-out细胞系（双拷贝敲除）：293T，hela细胞：建系成功率100%，目前成功建系19个，打靶效率约为30%-70%，最短耗时2个月ES/iPS细胞：建系成功率100%，目前成功建系7个，打靶效率约为20%-50%，最短耗时4个月数据统计至2013.07月打靶效率经验参考建立knock-in细胞系（单拷贝敲入）：293T、hela细胞等：建系成功率100%，目前已成功建系6个，打靶效率约为20%-55%，最短耗时3个月ES/iPS细胞：建系成功率100%，目前已成功建系2个，最短耗时5.5个月，打靶效率约为10%-28%数据统计至2013.07月应用实例2动物模型——斑马鱼Zebrafish-geneAWTTALEN580bpZebrafish-geneA(KpnI)WTTALEN580bp401bp179bpGenomicPCRRestrictiveenzymedigest斑马鱼内XX基因敲除结果反馈我方设计TALEN识别序列；提供最终的TALEN质粒TALEN质粒线性化；体外转录显微注射一细胞期受精卵48h后收集，抽提10-15个胚胎的基因组DNA，混合PCR扩增，酶切看结果打靶效率为80%以上应用实例3动物模型——小鼠设计构建TALEN打靶载体细胞水平TALEN活性检测体外转录生成mRNA往受精卵注射mRNA嵌合体小鼠（F0）F1heterozygoteF2homozygote

应用实例3动物模型——小鼠leptinRFoundersidentificationbyT7E1mismatchsensitiveassayssequencesofTALEN-inducedmutationsinleptinRlocusindifferentstrains应用实例3动物模型——小鼠LeptinReceptorTALENedF0founderWTlittermateC57BL6strainFVBstrainLeptinReceptorTALENedF0founderWTlittermate斯丹赛部分成功案例

北京大学

张老师成功建立人ES细胞某基因敲除系北京大学

尹老师成功建立人结肠癌细胞某基因敲除系长征医院周老师成功建立乳腺癌细胞某基因敲入细胞系清华大学

罗老师成功建立小鼠ES细胞某基因敲入系中国科学院生物物理研究所范老师成功建立小鼠MEF细胞某基因敲除系中国科学院上海生化所

宋老师利用培训班拿到的平板直接建立仓鼠细胞某基因敲除系；细胞建系成功案例斯丹赛部分成功案例

华东师范大学

王老师成功得到某基因敲除小鼠模型，打靶效率30%南京大学官老师成功得到某基因敲除小鼠模型，打靶效率12.7%南方模式

费老师成功得到某基因敲除小鼠模型华东师范大学

李老师成功得到某基因敲除小鼠模型小鼠建模成功案例斯丹赛部分成功案例

中国科学院水生生物研究所

肖老师成功得到斑马鱼F1代杂合子，效率为14/16，并且后续得到F2代纯合子复旦大学

姚老师成功得到斑马鱼某基因敲除的F1代杂合体

中国科学院健康科学研究所

荆老师成功的得到了斑马鱼突变体，打靶效率达20%；华