电泳技术和蛋白质测定

电泳技术

在分子生物学中的应用

电泳是带电荷的胶体颗粒在电场中的移动。

净电荷：生物大分子如蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒形式分散在溶液中，它们的净电荷取决于介质的H+浓度与其他大分子的相互作用。电场支持介质电泳的三要素

以淀粉胶、琼脂或琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等作为支持介质的电泳法称为凝胶电泳。琼脂糖凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳

（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）

凝胶电泳要点内容影响DNA在琼脂糖凝胶电泳迁移速率的原因有哪些？Westernblotting的基本试验环节,及每一步的操作意义。琼脂糖（agarose）是由琼脂分离制备的链状多糖。其构造单元是D-半乳糖和3.6-脱水-L-半乳糖。许多琼脂糖链依氢键及其他力的作用使其相互盘绕形成绳状琼脂糖束，构成直径从50nm到略不小于200nm的三维筛孔的通道。

琼脂糖凝胶电泳

凝胶中的琼脂糖含量[%（w/v）]线状DNA分子的有效分离范围（kb）0.35~600.61~200.70.8~100.90.5~71.20.4~61.50.2~32.00.1~2琼脂糖浓度：根据被分离线状DNA片断的大小选择凝胶的制备

以琼脂糖为溶质，电泳缓冲液为溶剂，配制一定浓度的溶胶，加热煮沸，冷却到50度左右，灌入水平胶框，插入梳子。缓冲液系统常用的电泳缓冲液有EDTA(pH8.0)和Tris-乙酸(TAE)，Tris-硼酸(TBE)或Tris-磷酸(TPE)等。

样品配制与加样

DNA样品用适量Tris-EDTA缓冲液溶解，缓冲液内具有0.25%溴酚蓝或其他指示染料，以及10～15%蔗糖或5～10%甘油，以增长其比重，使样品集中。电泳在低电压条件下，线性DNA分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。所以，为了取得电泳分离DNA片段的最大辨别率，所用电压不宜高于5V/cm。cm：电场正负极间的距离。

染色和拍照

常用荧光染料溴化乙锭(EB)染色，在紫外光下观察DNA条带，用凝胶成像系统输出照片，并进行数据分析。

溴化乙锭(EB)具有一种能够嵌入DNA或RNA的堆砌碱基之间的一种平面基团，与核酸结合后在紫外线激发下呈现橘黄色荧光，荧光的位置代表核酸片段所在的位置，荧光的强弱代表核酸量的多少,能够检测到少至10ng的DNA条带。可用于检测单链或双链核酸(DNA和RNA)。 将一系列已知分子量的原则DNA的迁移率与其相应的分子量对数作图，可取得一条原则曲线，未知DNA片段与其在相同条件下进行电泳，经过原则曲线，利用电泳迁移率即可求得其分子量。双链DNA分子在凝胶电泳中的迁移率与其碱基对数目的常用对数成反比。影响DNA在琼脂糖凝胶中的迁移速率的原因DNA分子的大小琼脂糖浓度DNA的构象：超螺旋环状(I型)、切口环状(II型)和线状(III型)；共价闭环DNA＞直线DNA＞开环双链DNA。所用的电压：低电压时，DNA片段迁移率与所用的电压成正比；电场强度升高时，高分子质量片段的迁移率遂不成百分比的增长。电泳缓冲液溴化乙锭聚丙烯酰胺凝胶电泳

（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）

聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体，在催化剂TEMED(N，N，N，N‘一四甲基乙二胺)和过硫酸铵的作用下，聚合形成聚丙烯酰胺长链，进一步在交联剂N，N’一亚甲双丙烯酰胺参加下，聚丙烯胺链与链之间交叉联接而形成凝胶。与琼脂糖凝胶电泳的比较,PAGE的特点

最适合分离小片段DNA(5～500bp),能够分离蛋白质；辨别力很强，长度上相差1bp的DNA即可分开；聚丙烯酰胺凝胶一律进行垂直电泳；装载更多的DNA量；从聚丙烯酰胺凝胶中回收的DNA纯度很高，可合用于要求最高的试验(如胚胎注射)。琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS(十二烷基磺酸钠)，SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级构造，同步，在强还原剂(beta-巯基乙醇)作用下，使半胱氨酸之间的二硫键断裂。蛋白质在一定浓度的具有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按百分比结合(多肽和SDS的质量比为1:1.4)，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，所带的负电荷大大超出了蛋白质分子原有的电荷量，从而消除了不同分子之间原有的电荷差别。蛋白质-SDS复合物的形状近似于长的椭圆棒，它们的短轴是恒定的，而长轴与蛋白质分子量的大小成百分比。蛋白质-SDS复合物在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中的迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于椭圆棒长轴的长度，即蛋白质亚基分子量的大小。当蛋白质分子量在15～200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。在不连续缓冲体系中进行，其电泳槽缓冲液的pH值与离子强度不同于配胶缓冲液；不连续缓冲体系具有把样品中的复合物全部浓缩于极小体积的能力，故提升了SDS的辨别力；系统中全部组分都具有0.1%的SDS。SDS的特点负极积层胶分离胶正极配置积层胶分离胶丙烯酰胺浓度5%10-15%Tris-HCl1M，PH=6.81.5M，PH=8.8SDS，过硫酸铵，TEMED浓度相同电泳积层胶分离胶电压80V120VTris-甘氨酸电泳缓冲液(pH8.3)的电离情况甘氨酸→带负电的蛋白质亚基→Cl-带负电的蛋白质亚基→甘氨酸-→Cl-蛋白质亚基的电离情况蛋白质亚基不被分离，而是被压缩为最小体积蛋白质亚基根据分子量的大小被分离

考马斯亮蓝染色(0.1-1.0ug的多肽)One-DimensionalSDS

蛋白质是两性电解质，在等电点pI时，蛋白质正负电荷量相等，净电荷为零。和pI相比，在碱性溶液中成阴离子，在酸性溶液中成阳离子。等电聚焦电泳IsoelectricFocusing(IEF)利用具有pH梯度的支持介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。

在电泳介质中放入载体两性电解质，当通以直流电时，两性电解质即形成一种由阳极到阴极逐渐增长的pH梯度。在此体系中，不同蛋白质即移动、汇集于其相应的pI位置，形成一种很窄的区带。区带的位置是由pH梯度的分布和蛋白质的pI所决定，而与蛋白质分子的大小和形状无关。

电泳时可将样品置于凝胶的任何位置；初始位置在负极时，因pH＞pI，蛋白质分子带负电，电泳时向正极移动；移动过程中，pH逐渐下降，所带负电荷量逐渐降低，蛋白质移动速度减慢；当移动到pH=pI时，蛋白质所带净电荷为零，蛋白质即停止移动。Two-DimensionalSDSPI(byisoelectricfocusing–IEF)Approximatemolwt.(bySDSPAGE)SDS成果凝胶电泳blotting固相支持物探针反应成果分析印迹法(blotting)是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种措施。Westernblotting1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜(NC膜)上，并利用杂交检测特定的DNA片段的措施，称为Southern印迹法。对RNA的印迹分析称为Northern印迹法。对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法。对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。WesternBlotting

基本原理在电场的作用下，将经过SDS电泳分离的待测多肽从凝胶转移至一种固相支持物，然后利用这种多肽的特异抗体看待测分子检测。蛋白提取SDS转膜封闭一抗作用标识二抗作用成果检测Westernblotting基本环节转膜：将凝胶和固相支持物像三明治一样夹在用缓冲液湿润的滤纸之间，在电场的作用下，带负电荷的蛋白质由凝胶转移到固相支持物。

正极三层滤纸硝酸纤维素滤膜凝胶三层滤纸负级

转膜效果检测丽春红S染色（硝酸纤维素滤膜）预染蛋白marker考马斯亮蓝染色（SDS-聚丙烯酰胺凝胶）抗体孵育把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤膜面积以0.1ml/cm2的量加入一抗溶液与滤膜温育，4℃过夜。弃掉一抗溶液，用PBST(或TBST)漂洗滤膜3次，每次10min。加入二抗溶液，摇床上缓慢摇动，37℃2小时。弃掉二抗溶液，用PBST(或TBST)漂洗滤膜3次，每次10min。封闭膜上的空白位点脱脂奶粉(5％)BSA(牛血清白蛋白)成果检测:二抗与底物反应显色辣根过氧化物酶法（HRP）碱性磷酸酶法（AP）蛋白检测方法特点应用蛋白印迹蛋白质亚基、修饰的检测信号通路中功能分子的研究放射性免疫分析微量蛋白质（尤其是体液）的定量检测受放射性核素半衰期的制约，科研研究中受到一定的限制，临床应用较广。放免试剂盒的种类比较少。酶联免疫吸附（ELISA）测定微量蛋白质（尤其是体液）的定量检测，适用于大样本批量检测科研研究广泛使用；ELISA试剂盒种类比较多。免疫组织细胞化学保留组织细胞固有的形态结构，可以对靶蛋白质定位细胞结构和功能的分析蛋白检测常用的试验措施放射性免疫分析（radioimmunoassay,RIA）将具有高敏捷度的放射性核素（如125I）示踪技术与高特异性的免疫化学技术结合，建立的一种体外超微量蛋白质分析法。用于定量测定受检标本中的蛋白质，尤其合用于微量蛋白质、激素和多肽的定量测定。探讨内容：基本原理基本试剂应用基本原理1、标识抗原(Ag*)、非标识抗原(Ag)和特异性抗体(Ab)三者同步存在于一种反应体系，标识抗原和非标识抗原(原则品或待测样本)对特异性抗体具有相同的结合力，两者相互竞争结合限量的特异性抗体。Ag*+Ab↔Ag*Ab+Ag↕AgAb

2、标识抗原和抗体的量是固定的，非标识抗原是变化的。标识抗原与非标识抗原与限量的抗体发生竞争性结合。反应达成平衡时，标识抗原抗体复合物形成的量就伴随非标识抗原的量而变化。非标识抗原量增长，相应地结合较多的抗体，从而克制标识抗原对抗体的结合，使标识抗原抗体复合物相应降低。反应达成平衡时，标识抗原抗体复合物的放射性强度与受检标本中抗原的浓度呈反比；而游离的标识抗原放射性强度与受检标本中抗原的浓度呈正比。

3、将Ag*Ab与游离Ag*分开，分别测定其放射性强度，就可算出结合态的Ag*(B)与游离态的Ag*(F)的比值(B/F)，或算出其结合率[B/(B＋F)]。用一系列不同剂量的原则抗原进行反应，计算相应的B/F，能够绘制出一条剂量反应曲线(竞争克制曲线)。4、受检标本在一样条件下进行测定，计算B/F值，即可在剂量反应曲线上查出标本中抗原的含量。剂量反应曲线

基本试剂1、原则品原则品是放射免疫分析法定量的根据，原则抗原的基本要求：原则抗原与待测抗原的免疫性必须一致，即它们与抗体的亲和力和特异性相同。抗原纯度必须高。原则抗原的量必须精确。原则抗原应有很好的稳定性。2、标识物①比放射性高，以确保措施的敏捷度；②免疫活性好；③所用的核素的半衰期尽量长，标识一次可较长时间使用，这对来之不易的抗原尤其主要；④标识简便、易防护。标识用的放射核素有γ射线和β射线两大类。β射线有14C、3H和32P；γ射线主要为131I、125I、57Cr和60Co，125I是目前常用的RIA标识物。3、抗体抗血清中具有对其相应抗原的特异性抗体。目前常以抗原免疫年轻、健康的纯种小动物而诱发产生多克隆抗体，选用特异性高、亲和力强及滴度高的血清，为RIA所用。4、缓冲液目前最常用的缓冲液有下列几种：①磷酸盐缓冲液；②醋酸盐缓冲液；③Tris–HCl缓冲液；④硼酸缓冲液。其中以磷酸盐缓冲液应用最多。

5、B与F分离在RIA反应中，标识抗原和特异性抗体的含量极微，所以需用一种合适的沉淀剂使它彻底沉淀，以完毕与游离标识抗原（F）的分离。非特异性分离法(1)吸附法：利用表面活性物质将反应液中的小分子游离部分F吸附，经过离心，将F沉淀，使大分子结合物B留在上清液中，而达成分离的目的。如:活性炭+葡聚糖吸附法。(2)过滤法：反应液中B与F混合物在经过一定规格孔径的滤膜时，大分子不会经过滤膜孔被阻留在滤膜上，小分子游离的放射性物质F被抽吸经过滤膜而分离。

(3)聚乙二醇(PEG)沉淀法：用PEG溶液替代第二抗体作沉淀剂。PEG沉淀的主要优点是制备以便，沉淀完全。缺陷是非特异性结合率比用第二抗体高，且温度高于30℃时沉淀物轻易复溶。特异性分离法在抗原与特异性抗体反应后加入第二抗体，形成由抗原－第一抗体－第二抗体构成的双抗体复合物。为提升分离效果,分离时加入一定量的与一抗同种动物的血清或IgG，使之与第二抗体形成可见的沉淀物，与上述抗原的双抗体复合物形成共沉淀。双抗体法具有特异、高效、非特异性结合低、反复性好等优点。应用1、心血管功能类：血栓素(TXB2)——消炎痛-EDTA抗凝6-酮-前列腺素F1α——消炎痛-EDTA抗凝内皮素ET——抑肽酶-EDTA抗凝降钙素基因有关肽——抑肽酶-EDTA抗凝心钠素ANP——抑肽酶-EDTA抗凝肾上腺髓质素ADM——抑肽酶-EDTA抗凝醛固酮——肝素抗凝应用2、多肽因子类：TNF、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-8、IL-10、粒细胞-集落细胞刺激因子、胰岛素样生长因子-2、红细胞生成素(EPO)等。3、脑-肠肽类

胃动素(MTL)——抑肽酶-EDTA抗凝神经降压素(NT)——抑肽酶-EDTA抗凝神经肽(NPY)——抑肽酶-EDTA抗凝胃泌素——血清应用4、骨代谢类骨钙素(BGP)——血清；降钙素(CT)——血清甲旁素有关肽——抑肽酶-EDTA抗凝5、甲状腺功能类游离T3、游离T4、甲状腺球蛋白TG、总T3、总T4。6、肿瘤检测类甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、铁蛋白、β2微球蛋白7、糖尿病类胰岛素、胰高血糖素、胰岛素抗体、C-肽8、吗啡、叶酸、维生素、性激素类EnzymeLinkedImmunosorbentAssay（ELISA）将过量抗体（抗原）包被于载体上，经过抗原抗体反应使酶标识抗体（抗原）也结合在载体上，经洗涤清除游离的酶标识抗体（抗原）后，加入底物显色，定性或定量分析有色产物从而拟定待测物的存在与含量。可用于测定抗原，也可用于测定抗体。ELISA基本过程1、包被：抗体(抗原)吸附在固相载体上2、复合物的形成：加待测抗原(抗体),再加相应酶标识抗体(抗原),生成抗体(抗原)--待测抗原(抗体)--酶标识抗体的复合物。3、酶与底物反应：经过酶和底物反应，将待测抗原(抗体)的量转化为溶液颜色的不同深度。4、检测：溶液颜色的深浅经过酶标仪读取OD值，这么，待测抗原(抗体)的量和OD值大小有关联。ELISA常用类型类型固相载体上的包被物待测物酶标记物显色程度与待测物含量间的关系双抗体夹心法（一步法）抗体A抗原酶标抗体B正相关间接法抗原抗体酶标二抗正相关竞争法抗原（抗体）抗体（抗原）酶标抗体（抗原）负相关捕获法抗IgMIgM酶标抗体正相关加底物洗涤受检标本酶标抗体B洗涤保温洗涤保温固相抗体抗原抗体A酶标抗体B

酶标仪检测OD值利用待测抗原上的两个抗原决定簇A和B分别与固相载体上的抗体A和酶标识抗体B结合，形成抗体A-待测抗原-酶标抗体B复合物，复合物的形成量与待测抗原含量成正比。此法合用于测定二价或二价以上的大分子抗原，不合用于测定半抗原及小分子单价抗原。双抗体夹心法测抗原固相抗原洗涤受检血清洗涤酶标抗抗体抗原抗体抗抗体酶标洗涤加底物保温保温酶标仪检测

OD值间接法测抗体将已知抗原连接在固相载体上，待测抗体与抗原结合后再与酶标二抗结合，形成抗原-待测抗体-酶标二抗的复合物，复合物的量与待测抗体量成正比。利用特异性病原体抗体，而进行传染病的诊疗。优点:只要变换包被抗原，就能够利用同一酶标二抗建立检测相应抗体的措施。

竞争法用酶标抗原(抗体)与待测的非标识抗原(抗体)竞争性的与固相载体上的限量抗体(抗原)结合，待测抗原(抗体)多，则形成非标识复合物多，酶标复合物就少，故显色程度与待测物含量成反比。用于小分子激素、药物等测定。

加底物酶标抗原受检标本酶标仪检测OD值固相抗体抗体待测抗原酶标抗原待测抗原和酶标抗原与限量抗体竞争结合捕获包被法测抗体(IgM)

抗原酶标抗体洗涤保温受检血清洗涤抗原保温抗IgM固相抗体抗IgM抗体IgM抗原酶标抗体加底物酶标仪检测

OD值先用抗IgM抗体包被固相，以捕获血清标本中的IgM(其中涉及针对抗原的特异性IgM和非特异IgM)，然后加入抗原，此抗原仅与特异性IgM相结合，再加酶标识针对抗原的特异性抗体，最终加入底物作用，溶液呈色即与标本中特异性IgM的量成正有关。此法常用于病毒性感染的早期诊疗。原则品浓度X吸光度（OD)Y10 2.2575 1.6512.5 1.0491.25 0.6050.625 0.3560.3125 0.2390.156 0.1640 0.074Hill曲线拟合方程:y=ymax*x^n/(k^n+x^n)ymax=3.46032k=6.00154n=1.06288r^2=0.99252免疫细胞化学（一）标本的搜集与处理1、组织标本的取材与储存起源：活检取材、手术切除、试验动物组织等。要求：要快、要小(1×1×0.4cm)、防止挤压。处理：冰冻→冰冻切片；固定→石蜡切片。2、细胞标本的取材与储存起源：血细胞、穿刺细胞、体液细胞等。处理：细胞多时直接涂片、干燥、固定。细胞少需离心沉淀、涂片、干燥、固定。贴壁生长细胞

（二）固定1、固定的含义固定是用某种化学物质使蛋白质、酶类(变性)、脂质、糖类等物质保持在组织细胞原位，防止Ag溶解、扩散、丢失；保持组织细胞的正常形态构造。2、固定剂的选择多糖冷的饱和苦味酸(750ml)甲醛(250ml)冰醋酸(50ml)核蛋白及核酸醋酸或三氯醋酸(TCA)酶丙酮蛋白质10%的formalin或4%的多聚甲醛

（三）组织的脱水、浸蜡、包埋和切片前三步只用于石蜡切片，冰冻切片不需此环节。1、常规石蜡包埋过程(1)脱水：75％、85％乙醇，95％乙醇，无水乙醇

(2)透明：二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ(3)浸蜡：石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ、石蜡Ⅲ(4)石蜡包埋：脱水透明后，用石蜡、火棉胶、环氧树脂等支持剂透入组织内部使之变硬(利于切片)的过程。石蜡包埋适于绝大多数组织学和组化技术。(5)修蜡块，标号包埋2、切片石蜡切片：脱水、透明、浸蜡、包埋、切片5-7μm冰冻切片：浸糖:20%-30%蔗糖4℃过夜，降低冰晶；OCT(聚乙二醇+聚乙烯醇)包埋，液氮速冻，减轻组织破坏。病理切片要薄，5-7μm；脑片一般30-50μm，有利于追踪神经纤维的走行。(四)消除内源性酶

①内源性过氧化物酶的消除措施：0.3～3%H2O2甲醇溶液浸泡20min②内源性碱性磷酸酶的消除措施

左旋咪唑(24mg/ml)加入底物液中,并保持pH7.6-8.2。(七）免疫反应1、一抗4℃过夜（或37℃2小时）。2、二抗37℃30分钟。3、成果检测①滴加底物在显微镜下显色，适时终止。②荧光显微镜检测（八）核染色：苏木素复染或DAPI染色（九）脱水、透明、封片。肾小球磷酸化IKK免疫组化成果，200X

蛋白质相互作用２００种蛋白质及２０００种组合构造进行解析后，发觉其中三分之一的蛋白质相互组合会造成疾病，轻易造成疾病的蛋白质和其他蛋白质结合后来也将变得十分活跃，致使发病和病情恶化。绝大多数疾病都是由１０万种以上的特定蛋白质相互作用所致。蛋白质－蛋白质相互作用和辨认在诸如生物催化、转运、信号传导、免疫、细胞调控等多种生命过程起着主要的作用。结构域相关特点代表蛋白质Set结构域是一种介导蛋白质-蛋白质间相互作用的结构域，已证明它可以与一种类似双重特异磷酸酶蛋白家族作用Rb结合锌指蛋白Sam结构域是进化上保守的蛋白质结合结构域，参与调节各种真核细胞的发育过程，可凭借SAM结构域为基础形成同二聚体，或异源二聚体丝氨酸/酪氨酸蛋白激酶Tpr结构域由34个氨基酸残基构成，分布广泛，常构成脚手架样结构，介导蛋白质作用，且常形成较大的复合体分裂后期启动复合体亚单位（cdc16,cdc23和cdc27）WD40结构域在高等真核细胞G蛋白β亚单位中有8个随机重复序列，每个由40个氨基酸残基构成，而每一个都含有中央的Trp-Asp模块，因而称为WD40，该结构域可以介导蛋白质相互作用凋亡蛋白酶活化因子1（Apaf）SRCR结构域多见于细胞表面分子和一些分泌蛋白，功能是参与配体介导结合Mac2结合蛋白SH2结构域由大约100个左右氨基酸构成，含有SH2结构域的蛋白质可以利用SH2结构域与其靶肽上磷酸化的酪氨基酸残基的高特异性的结合为调节细胞信号转导链，这种作用是序列特异的，且是磷酸化依赖的STAT蛋白可能参加蛋白质-蛋白质间相互作用的构造域蛋白质相互作用的研究措施1.酵母双杂交2.免疫共沉淀和GSTpulldown3.荧光共振能量转移4.质谱转录因子的构造特点转录因子从功能上分析其构造可包具有不同区域，①DNA结合域(DNAbindingdomain)②转录激活域(activatingdomain)③连接区酵母激活因子GAL4：N端：147个氨基酸构成的DNA结合域(DNAbindingdomain,BD)，C端：113个氨基酸构成的转录激活域(transcriptionactivationdomain,AD)。GAL4分子的DNA结合域能够和上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)结合，而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。构成部分：（1）与BD融合的蛋白体现载体，被体现的蛋白称诱饵蛋白（bait）；（2）与AD融合的蛋白体现载体，被其体现的蛋白称靶蛋白（prey）；（3）带由一种或多种报告基因的宿主菌株。酵母双杂交系统YeastTwoHybrid原理BDXCOOHADcDNANH2

COOH共转化+BDX?ADGal4Gal4PromoterReporterTrp-Leu-cDNAlibraryNH2Gal4Gal4双杂交系统的原理LacZGal4激活域Gal4结合域Gal4结合域Gal4结合域LacZLacZGal4激活域LacZGal4激活域Gal4结合域XYXY酵母双杂交系统：将编码某一蛋白X的DNA序列与DNA结合域BD的编码序列融合形成一种杂交体，将编码另一蛋白Y的DNA序列与DNA激活域AD的编码序列融合形成另一种杂交体，当两个杂交体共转化酵母细胞（此酵母细胞上游有DNA结合位点的报告基因），若X和Y没有相互作用，则单独不能激活报告基因的转录；若X和Y可相互作用，则使BD和AD接近形成一种有效的转录激活子，激活报告基因的转录。所以可经过检测报告基因的转录来研究蛋白质X和Y的相互作用。

1）已知蛋白之间相互作用的检测；2）蛋白质的功能域研究：经过对其中某一种蛋白质作缺失或定点突变，再用此系统检测是否还存在相互作用，可阐明其功能域或关键氨基酸；3）克隆新基因和新蛋白：将感爱好的蛋白质基因与BD基因构建成“诱饵”体现质粒，将某一器官或组织的cDNA文库与AD基因构建成“猎物”基因库，共转化酵母细胞，可筛到与感爱好蛋白质相互作用的蛋白质的cDNA序列，并推测其蛋白质序列。

酵母双杂交系统作用

免疫沉淀（IP）是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种措施。抗体与细胞裂解液或体现上清中相应的蛋白结合后，再与蛋白A/G（ProteinA/G）或二抗偶联的agarose或Sepharose珠子孵育，经过离心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗体-目的蛋白复合物，沉淀经过洗涤后，重悬于电泳上样缓冲液，煮沸5-10min，在高温及还原剂的作用下，抗原与抗体解离，离心搜集上清，上清中涉及抗体、目的蛋白和少许的杂蛋白。

免疫共沉淀免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白