复方酮康唑纳米乳的制备及稳定性研究

复方酮康唑纳米乳的制备及稳定性研究

酮康唑是一种广泛的抗真菌药物，对各种真菌都有抗菌和杀菌作用。丙酸氯仿是一种用于调节神经皮炎、慢性湿疹和瘙痒的外包药物的外包药物。丁香酚属于类酸萘，具有抗菌、谋杀、促进透皮吸收等多种药理活性。以上3种药物均存在难溶和难吸收的问题。国内外市场上外用剂型主要以软膏和洗剂为主,存在透皮效果差,作用时间短等缺陷,导致生物利用度低,应用中往往以增加用药次数来提高其生物利用度,既增加了药物对机体的毒副作用,又促使机体产生耐药性。纳米乳是由水、油、表面活性剂和助表面活性剂等自发形成,粒径为1～100nm的热力学稳定、各向同性,透明或半透明的均相分散体系。纳米乳作为药物载体具有增容增敏,制备简单,稳定性好,促进吸收,生物利用度高,分散度好,注射无疼痛,粒径小,分布均匀,缓释和靶向作用等优点。近年来,国内外用纳米乳载体对难溶及药效低的药物进行改造的研究很多。BabetteB等研制了孕酮O/W型微乳。Hwang等制备了W/O注射用维甲酸微乳。沈锦秋等研制了氟比洛芬酯眼用纳米乳-离子敏感型原位凝胶。余东升等制备了黄芪注射液浓缩液微乳。本试验在市场上常见的酮康唑与丙酸氯倍他索的复方中加入了丁香酚并以纳米乳为载体研制出了复方酮康唑纳米乳,不仅提高了药物的透皮吸收率,弥补了此类药物现有剂型的不足,而且还加强了治疗小动物临床上常见的真菌螨虫混合感染皮肤病的功效,在药物生产中具有广泛的应用前景。1材料和方法1.1主要测试仪器JEM1230透射电镜(日本日立电子公司);BS214S电子天平(德国Satorius公司);TGL-16B台式高速冷冻离心机(湖南新星科学仪器公司);78HW-1型恒温磁力搅拌器(杭州仪表电机厂);Nicomp388/ZetaPALS激光粒度测定仪(ParticleSizingSystem,USA);HITACHI高效液相色谱仪(日本日立电子公司)。HC-188透皮扩散仪(天津市正通科技有限公司)。酮康唑(湖北恒硕化工有限公司);丙酸氯倍他索(武汉远程共创科技有限公司);丁香酚(恒诚天然香料提炼厂);肉豆蔻酸异丙酯(IPM,上海高维实业有限公司);聚氧乙烯蓖麻油(RH-40,德国BASF公司);聚氧乙烯蓖麻油(CremophorEL40,德国BASF公司);聚山梨酯80(Tween-80)、2-苯乙醇、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、1,2-丙二醇、甘油均为分析醇。SD大鼠,购于第四军医大学实验动物中心。1.2确定和准备工作1.2.1丁香酚、乙酸乙酯、丁香酚油相酮康唑与丙酸氯倍他索在2-苯乙醇中的溶解度较高,因此将2-苯乙醇作为油相的一部分,丁香酚也可作油相,另外还需加入分子链较短的IPM(C14)、乙酸乙酯(C4),原则上油相分子体积越小,溶解力越强,油相分子链过长不能形成纳米药物,选择二者中药物溶解度较高的做为油相。1.2.2表面活性剂的制备表面活性剂选择非离子型表面活性剂,即RH-40、EL-40、Tween-80,表面活性剂(SF)/助表面活性剂(CoSF),即Km=5时,将3种表面活性剂与油相按照9∶1～1∶9的比例混匀,在25℃条件下用磁力搅拌器搅拌,逐滴滴加蒸馏水至临界点,观察各组的变化。选择液体的外观呈澄清透明且平行光入射后有丁达尔现象,通过高速(13000r/min,30min)离心后纳米乳稳定不分层,通过透射电子显微镜观察和激光粒度仪测出该乳滴粒径在1～100nm之间的配比,记录各组分的质量百分比。通过Origin8.0软件绘制伪三元相图确定纳米乳的形成区域。见图1。1.2.3助表面活性剂的选择助表面活性剂在短链醇乙醇、甘油、1,2-丙二醇中选择较容易形成纳米乳的作为助表面活性剂。以油相、表面活性剂、水相为3个顶点,Km=5∶1～1∶1分别做伪三元相图,确定Km值(图2)。1.2.4复方酮康唑纳米乳的制备将选出的油与溶有酮康唑、丙酸氯倍他索的2-苯乙醇及丁香酚混匀作为油相,加入选定的表面活性剂与助表面活性剂,在25℃条件下用磁力搅拌器搅拌,逐滴加入配方量的蒸馏水即得复方酮康唑纳米乳。1.3质量控制1.3.1粒度和形态的观察用激光粒度测定仪测定复方酮康唑纳米乳的粒径大小。通过透射电子显微镜观察其形态,见图3、4。1.3.2药代动力学试验将复方酮康唑纳米乳以13000r/min离心30min进行加速试验,分别在室温、4℃、和37℃条件下考察30d,每隔5d观察1次,置于日光下照射10d,于1、3、5、10d取样观察;分别观察以上试验中药物外观及粒径有无明显变化。用高效液相色谱仪在设定的色谱条件下分别测定复方酮康唑纳米乳的回收率、精密度及含量,考察其稳定性(图5)。1.4氨基溶胶纳米乳外剂1.4.1复方酮康唑纳米乳的检测设复方酮康唑纳米乳组,加2.5%氮酮、5%氮酮的复方酮康唑纳米乳组,复方酮康唑软膏组,酮康唑、丙酸氯倍他索、丁香酚混悬液组(各组分浓度与复方酮康唑纳米乳相同)5个试验组。1.4.2标准曲线法测定接收点时间在接受池和扩散池中间移入制备好的鼠皮,加紧后接受池中加入PBS,扩散池中加入待试药液1mL,然后置于37℃循环水浴中,接受池转子搅拌速度为400r/min,加入样品后,分别于设定的时间间隔:0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12h由取样口取1mL接受液,同时补充等体积的PBS,将不同时间取出的接受液样品用同样的色谱条件进行吸光度的测定,代入回归方程。1.4.3取样点接受液的测量透皮接受液中各药物浓度按方程校正:C=Cn+(V0V)∑i=1n−1CiC=Cn+(V0V)∑i=1n-1Ci式中:C是接受液校正浓度(μmol/L),Cn是第n个取样点接受液样品的实测浓度(mg/mL),Σci是第n个取样点前实测浓度之和,V是接受室体积(即5mL),V0是每次取样的体积(即1mL)。校正浓度见图6。体外皮肤渗透速率按Fick’s扩散方程计算:Jss=VA×dcdtJss=VA×dcdt式中:Jss是稳态渗透速率(μg·cm-2·h-1),V是接受室体积(即5mL),A是皮肤有效扩散面积(即0.785cm2),c是接受室的校正浓度(mg/L),t是时间(h),dc/dt是接受液浓度与时间曲线的直线部分的斜率,稳态渗透率见表1。2结果与分析2.1油相原料的选择经试验证实酮康唑与丙酸氯倍他索在乙酸乙酯中的溶解度高于IPM,因此选择乙酸乙酯为油相的一部分,最终确定复方酮康唑纳米乳的油相为溶有丙酸氯倍他索与酮康唑的2-苯乙醇、乙酸乙酯、丁香酚混合液。考虑到2-苯乙醇的皮肤安全用量,未将其与丁香酚作为油相,而又加入了乙酸乙酯,使2-苯乙醇的用量保持在安全范围内。丁香酚其本身作为油相的一部分不仅可降低成本,而且可提高纳米乳的载药量。图1表明三者均能形成纳米乳系统,Km=5时,EL-40作为表面活性剂时形成纳米乳的乳区面积明显大于其他两种表面活性剂。因此选择EL-40为表面活性剂。乙醇、甘油、1,2-丙二醇均可形成纳米乳,其中乙醇较其他助表面活性剂在使用很少量时就可形成,因此选乙醇为助表面活性剂。图2表明Km=5时形成的纳米乳区面积最大,确定Km=5∶1。考虑到减少表面活性剂含量,保证一定载药量,药物稳定性等综合因素,将复方酮康唑纳米乳各成分的比例确定为EL-4024.29%、乙醇4.91%、2-苯乙醇4.17%、乙酸乙酯7.33%、酮康唑1%、丙酸氯倍他索0.05%、丁香酚1%、水57.25%。2.2复方酮康唑纳米乳回收率图3显示复方酮康唑纳米乳平均粒径为11.8nm,其中90.6%复方酮康唑纳米乳粒径介于8.72～28.2nm之间,9.4%介于5.61～7.53nm之间。图4表明复方酮康唑纳米乳为粒径大小不均的球形多分散体系乳液。加速离心、光稳定性、温度稳定性试验结果表明,复方复方酮康唑纳米乳试验后人保持澄清透明的淡黄色液体状态,无分层,析出、颜色等外观变化,粒径大小无明显变化。图5表明,纳米乳基质对复方酮康唑纳米乳中各药物含量测定无干扰,各药物之间也互不干扰。以浓度C对峰面积A进行线性回归,得酮康唑、丙酸氯倍他索、丁香酚的回归方程分别为A=30156C-54276R=0.9995(n=5),A=37380C-7200R=1(n=5),A=8049C+4203R=1(n=5),线性范围分别为60～220、2～10、5～165mg/L。平均回收率分别为99%,RSD=0.38%;101.5%,RSD=1.03%;98.7%,RSD=0.44%。表明回收率较高。日内、日间RSD分别为0.57%和1.03%;1.12%和1.88%;0.69%和1.24%。表明仪器精密度良好。纳米乳中主要成分的含量无明显变化。以上试验结果表明复方酮康唑纳米乳的稳定性较为理想。2.3稳态渗透率测定图6表明,无氮酮组与2.5%氮酮组的透皮速率无显著差异,其与2.5%氮酮组透皮速率高于含5%氮酮组。复方酮康唑纳米乳透皮效果显著高于混悬液组,复方酮康唑纳米乳中酮康唑和丙酸氯倍他索的透皮效果优于复方酮康唑软膏中两成分的透皮效果。由表1中稳态渗透速率可知,酮康唑的稳态渗透率,2.5%氮酮组,5%氮酮组,复方酮康唑软膏组,混悬液组分别是复方酮康唑纳米乳组的90%,76.4%,59.8%,53.8%。丙酸氯倍他索的稳态渗透速率,2.5%氮酮组,5%氮酮组,复方酮康唑软膏组,混悬液组分别是复方酮康唑纳米乳组的95.28%,75.6%,65.4%,35.4%。丁香酚的稳态渗透速率,2.5%氮酮组,5%氮酮组,复方酮康唑软膏组,混悬液组分别是复方酮康唑纳米乳组的95.4%,70.8%,33.6%。结果表明,复方酮康唑纳米乳的透皮效果明显优于混悬液、复方酮康唑软膏和含5%氮酮的复方酮康唑纳米乳,与含2.5%氮酮的复方酮康唑纳米乳的透皮效果相当。丁香酚的校正浓度明显高于其他两种有效成分,这可能与丁香酚其本身具有良好的透皮性能有关,在复方酮康唑纳米乳中,该成分良好的透皮性能可以提高生物利用度。3阿斯匹林的纳米乳皮肤病是小动物临床发病率较高、病理过程长、类型和症状鉴别难度大的疾病,占临床病历的20%,真菌性和寄生虫性皮肤病较多发,二者往往混合感染。一般情况下,肤病虽不致引起死亡,但治疗周期长,易复发,且可感染人体,应引起高度重视。病畜主要出现被毛粗乱,脱毛,瘙痒,皮肤出现痂皮,丘疹等症状。严重影响了犬的外观,尤其是观赏型犬,给畜主带来了很大的烦恼。工作犬,如警犬,导盲犬等由于皮肤病的困扰,也会影响正常工作。目前使用的外用制剂多为软膏和洗剂,其透皮性能不佳导致治疗效果不理想,同时治疗这两种皮肤病的外用药物也少有报道。复方酮康唑纳米乳是治疗小动物真菌性和寄生虫性皮肤病混合感染的纳米级外用制剂,可涂抹也可喷洒,使用方便。复方酮康唑纳米乳中的