不同提取方法提取水稻叶片总蛋白的比较

不同提取方法提取水稻叶片总蛋白的比较

1975年，o'farrils提出的双向沉淀电泳技术（2-de）是蛋白质组学中广泛使用的蛋白质分离技术。其基本原则是根据蛋白质的等电点（pi）和含量（mw）的大小，将其分离两次不同方向的电离作用，具有较高的分辨率和良好的重复性。蛋白质的提取是双向电泳中非常关键的一步,针对不同的研究目的选择适合的蛋白提取方法可以获得满意的二维电泳图谱。植物组织样品由于富含色素、酚、脂类、多糖等干扰物质,因而较难获得提纯的蛋白质。现有的用于植物组织双向电泳总蛋白提取方法主要包括三氯乙酸(trichlomaceticacid,TCA)/丙酮沉淀法、传统的酚法、十二烷基硫酸钠(SDS)法和镁/乙基苯基聚乙二醇(Mg/NP-40)提取法等。其中,在植物蛋白质组学尤其是在水稻蛋白质组学中最常用的蛋白提取方法是TCA/丙酮沉淀法。水稻(Oryzasativa)是一种重要的粮食作物,它因为基因组较小、分布广泛等优点而作为单子叶植物遗传和分子生物学研究的模式植物。随着水稻全基因组测序的完成,水稻蛋白质组的研究越来越被人们所重视。在使用双向电泳技术检测时,常由于高丰度蛋白的干扰而造成低丰度蛋白很难被检测到。在植物叶片中,1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Ribulose-1,5-BisphosphateCarboxylase/Oxygenase,RuBisCO)是可溶性蛋白中含量最高的蛋白质,大约占50%,由于它丰度极高,在使用双向电泳技术分离植物蛋白质组时常会使一些低丰度蛋白难以被检测到,给蛋白质组学分析造成一定困难。S.TaeKim等人用改进的Mg/NP-40提取法获得的水稻叶片总蛋白能够有效地减少分离蛋白中RuBisCO蛋白的含量,使双向电泳分析可以识别更多的低丰度蛋白。然而,TCA/丙酮沉淀法和Mg/NP-40提取法所获得的水稻叶片总蛋白在双向图谱中分布的具体情况,至今还无人报道。本研究采用TCA/丙酮沉淀法和Mg/NP-40提取法分别提取水稻苗期叶片的总蛋白,应用双向电泳技术进行分离分析,确定了这两种水稻叶片总蛋白提取方法在双向图谱中的分布特征。1材料和方法1.1水稻叶片总蛋白的提取采用水稻粳稻品种松粳6号(由五常种子公司提供),在实验室光照培养架培养(3000lux,25℃±2,光照16h/d)3周后用于提取水稻叶片总蛋白。1.2水稻叶片的提取(1)TCA/丙酮沉淀法:取1.5g水稻叶片在液氮中充分研磨至粉末状,并转移至无菌离心管中;加入9mL-20℃预冷的蛋白提取液Ⅰ(含0.07%β-巯基乙醇的10%三氯乙酸丙酮溶液)。充分混合后-20℃静置至少1h。4℃,15000r/min离心10min。弃上清。沉淀重悬浮于9mL-20℃预冷蛋白提取液Ⅱ(含0.07%β-巯基乙醇的丙酮溶液)中,-20℃放置1h。4℃,15000r/min离心10min,弃上清。重复清洗一次。沉淀重悬于9mL-20℃预冷的蛋白提取液III(含0.07%β-巯基乙醇的80%丙酮溶液)中,-20℃中静置1h。4℃,15000r/min离心10min,弃上清。将沉淀真空干燥后,研磨成粉末状,-80℃保存备用。(2)Mg/NP-40提取法:取1.5g水稻叶片在液氮中充分研磨至粉末状,并转移至无菌离心管中;加入10mL预冷的Mg/NP-40提取缓冲液(0.5MTris-HCl,pH值8.3,2%NP-40、20mMMgCl2、2%β-巯基乙醇、1mMPMSF、1%PVP),冰上放置30min。4℃,12000r/min离心15min。取上清,加入50mL-20℃预冷的丙酮,-20℃静置1h。4℃,3000r/min离心10min。弃上清,将沉淀真空干燥后,-80℃保存备用。1.3蛋白凝胶凝胶电泳用300μL水化上样缓冲液(8M尿素、4%CHAPS、6mMDTT、0.2%w/vBio-Lyte)溶解30mg蛋白粉。37℃水浴30min。4℃,12000r/min离心30s,取上清。Bradford法测定蛋白浓度。双向电泳采用Bio-Rad公司电泳系统,参照文献和Bio-Rad操作指南进行。IPG胶条为17cm(pH值4.0～7.0;Bio-Rad),第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳胶浓度为13%。染色采用银染。用普通凝胶成像系统(UVP)采集图像。每种蛋白提取方法的双向电泳进行三次重复。1.4图像统计分析采用ImageMaster图像分析软件(Amersham)对图像进行分析。编写工作组群,调整图像灰度使所有蛋白点都清晰可见,蛋白点检测时选取相同参数(smooth:4,MinArea:28,Saliency:1.5)。2可以有效识别低丰度蛋白点的比较2.1两种提取方法蛋白质双向电泳图谱比较采用双向电泳检测手段比较两种不同方法所获得的蛋白质(图1)。采用ImageMaster图像分析软件分析双向电泳图谱。TCA/丙酮沉淀法可检测到的蛋白点数为1019个(图1a),Mg/NP-40提取法可检测到的蛋白点数为1317个(图1b)。图1a有一条明显的横条纹,分子量大约为53kD。本实验室前期质谱鉴定指出图1a圆圈标示的蛋白点是1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Ribulose-1,5-BisphosphateCarboxylase/Oxygenase,RuBisCO)大亚基。用Mg/NP-40提取法获得的蛋白质,在53kD处没有那条横条纹,RuBisCO大亚基蛋白点几乎看不见(图1b),使更多的低丰度蛋白点可以被识别。2.3对不同等电点的蛋白分离效果的比较按照等电点的差异,将软件检测到的所有蛋白点进行归类(图2)。两种不同总蛋白提取方法所获得的蛋白质,在双向图谱中分离的等电点范围有差异。在pI为4～5范围内,TCA/丙酮沉淀法分离的蛋白有211个可被检测,但Mg/NP-40提取法分离的pI为4～5蛋白只有184个。在分离pI为5～6的蛋白和pI为6～7的蛋白时,Mg/NP-40提取法可检测到的蛋白点数分别为701个、432个,高于TCA/丙酮沉淀法(495个、313个)。将软件检测到的所有蛋白点按照在不同等电点区域蛋白点数百分比进行分析(图3)。结果显示,在分离pI为4～5的蛋白时,TCA/丙酮沉淀法分离百分比为20.7%,明显高于Mg/NP-40提取法(14.0%)。在分离pI为5～6的蛋白和pI为6～7的蛋白时,Mg/NP-40提取法分离百分比分别为32.8%,53.2%,高于TCA/丙酮沉淀法(30.7%、48.6%)。2.3对不同分子量的蛋白分离效果的比较按照分子量,可以将图1所检测到的蛋白点分为6组(图4),在分子量为31～43kD和43～67kD范围内,TCA/丙酮沉淀法可检测到的蛋白点数分别为303个、367个,高于Mg/NP-40提取法(287个、325个)。在分子量为14～20kD和高于67kD范围内,Mg/NP-40提取法可检测到的蛋白点数分别为270个、116个,高于TCA/丙酮沉淀法(86个、28个)。在分子量小于14kD和20～31kD范围内,两者分离能力相似。将软件检测到的所有蛋白点按照不同分子量区域内蛋白点数百分比进行分析(图5),结果显示,在分子量为31～43kD和43～67kD范围内,TCA/丙酮沉淀法分离百分比分别为29.72%、36.02%,明显高于Mg/NP-40提取法(21.79%、24.68%)。在分子量为14～20kD和高于67kD范围内,Mg/NP-40提取法分离百分比分别为20.44%、8.87%,明显高于TCA/丙酮沉淀法(8.44%、2.75%)。在分子量小于14kD和20～31kD范围内,两者分离能力相似,TCA/丙酮沉淀法分离百分比分别为1.28%、21.79%,Mg/NP-40提取法分离百分比分别为1.82%、22.40%。3中心、范围内双向电泳分离蛋白的比较经过对两种不同总蛋白提取方法的比较,Mg/NP-40提取法可检测到的蛋白点数(1317个)要略微高于TCA/丙酮沉淀法(1019个)。从图1中可以看出,相对于TCA/丙酮沉淀法,Mg/NP-40提取法可以有效地减少水稻叶片中RuBisCO大亚基,提高水稻叶片蛋白质组检测水平,使得一些低丰度蛋白可以被检测到。这一结果与S.TaeKim相一致。RuBisCO是光合碳同化作用的关键酶,也是光合作用的限速酶。在植物叶片中,RuBisCO是可溶性蛋白中含量最高的蛋白质,是植物体内一种重要的储藏蛋白。RuBisCO的存在干扰了低丰度蛋白的检测。而在生物体内,低丰度蛋白质往往是执行重要生物功能的蛋白质,如调控蛋白,受体蛋白等。因此,检测低丰度蛋白对于植物蛋白质组学是非常重要的。在对不同等电点的蛋白分离效果的比较上,TCA/丙酮沉淀法更适于分离等电点在4～5范围内的蛋白质,其分离蛋白点数和分离百分率都要高于Mg/NP-40提取法。其中,将两种方法分离的百分率相比较,TCA/丙酮沉淀法高出6.7%。而对于等电点在5～7范围内的蛋白质,更适于采用Mg/NP-40提取法对蛋白质进行分离。在等电点6～7范围内,Mg/NP-40提取法分离百分率略高于TCA/丙酮沉淀法。在等电点5～6范围内,Mg/NP-40提取法分离百分率高出TCA/丙酮沉淀法4.6%。在对不同分子量的蛋白分离效果的比较上,TCA/丙酮沉淀法更适合分离分子量为31～67kD范围内的蛋白。在分离分子量为31～43kD范围内的蛋白时,两种方法分离百分率相差7.93%。在分离分子量为43～67kD范围内的蛋白时,两种方法分离百分率相差11.34%。虽然后者明显高于前者,但是,在分子量为43～67kD范围内存在着大量的RuBisCO大亚基及其大亚基前体蛋白,高丰度的RuBisCO大亚基干扰了低丰度蛋白的检测。Mg/NP-40提取法分离蛋白百分率比TCA/丙酮沉淀法要低,但是由于它有效的减少了RuBisCO蛋白,使得一些低丰度蛋白能够被检测到,更适合用来分析低丰度蛋白的变化。如果想要检测尽可能多的蛋白点或者是RuBisCO蛋白,采用TCA/丙酮沉淀法更适合。Mg/NP-40提取法更适合分离分子量为14～20kD和大于67kD范围内的蛋白。在分离分子量为14～20kD范围内的蛋白时,Mg/NP-40提取法可检测到的蛋白点数比TCA/丙酮沉淀法可检测到的蛋白点数多出184个,分离百分比差值为12%。在分离分子量大于67kD范围内的蛋白时,Mg/NP-40提取法可检测到的蛋白点数比TCA/丙酮沉淀法可检测到的蛋白点数多出88个,分离百分比差值为6.12%。结果显示,Mg/NP-40提取法更适合分离分子量在14～20kD范围内的蛋白。在分离