不同时间滴鼻免疫小鼠对可溶性速殖子抗原的阻断作用

不同时间滴鼻免疫小鼠对可溶性速殖子抗原的阻断作用

新地快虫是一个全球分布的系统，在广泛寄生于文血动物的特殊细胞中，导致原生动物的共病，导致人类疾病。免疫功能正常者多为隐性感染,孕期感染可通过胎盘垂直传播给子代,或导致流产、早产、死产及胎儿先天性弓形虫病等异常妊娠结局。本病尚无有效防治药物,研制有效的弓形虫疫苗迫在眉睫。近年来,国内外学者对于弓形虫先天性感染的疫苗研究取得显著进展。可溶性速殖子抗原(STAg)单独或联合包囊抗原皮下免疫小鼠可降低胎鼠的死亡率。单联喆等给感染弓形虫孕鼠腹腔注射一定剂量的rhuIL-2,可使活胎数增加、垂直传播率降低。Haumont等用重组SAG1核酸疫苗于孕前2周免疫豚鼠,孕期感染弓形虫速殖子,疫苗组胎鼠感染率为14%,对照组为86%。上述研究表明疫苗能减低弓形虫垂直传播的发生。本实验室经过大量实验证实STAg有较好的免疫原性,并已建立弓形虫经口感染的垂直传播动物模型。本研究采用STAg于妊娠前不同时间滴鼻免疫BALB/c小鼠,观察诱导的孕鼠免疫反应、抗感染作用及对胎鼠的保护作用,为研制阻断弓形虫垂直传播疫苗提供实验依据。1材料和方法1.1弓形虫、rh株BALB/c小鼠引自中国医学科学院实验动物研究所,微生物级别为二级。引入后二级动物室内近交繁殖。国际标准强毒RH株弓形虫,引自北京大学医学部寄生虫学教研室,本室液氮保种。常规复苏的速殖子腹腔接种BALB/c小鼠,转种3代,收集腹腔冲洗液,洗涤净化后计数速殖子,用于STAg制备和攻击孕鼠。1.2妊娠合并心脏病阴栓感染时间5-6周龄BALB/c雌鼠130只,有交配经验的BALB/c雄鼠20只。将处女鼠随机分为STAg组和PBS组,分别以STAg(20μg/只)和PBS(20μl/只)滴鼻免疫2次,间隔2周。末次免疫后雌雄鼠以2∶1分批交配,每日清晨观察阴栓,发现阴栓当日为妊娠第0天。STAg组和PBS组各获得孕鼠30只,按末次免疫时间的不同各组分为3小组(每组10只),分别为妊娠前3,9,15d末次免疫,即PBS3、PBS9、PBS15组和STAg3、STAg9、STAg15组。妊娠第8天用8000个/只速殖子灌胃攻击各组小鼠。于妊娠第18天颈椎脱臼处死,记录孕鼠健康状况、活胎率,ELISA法测定孕鼠小肠冲洗液sIgA水平,以及孕鼠肝、胎盘和胚胎脑组织弓形虫抗原。1.3stag生产将弓形虫RH株速殖子洗涤净化后,按照文献方法制备STAg,-20℃保存备用,用于滴鼻免疫和酶标板包被。1.4观察胚胎发育情况妊娠第18天颈椎脱臼处死孕鼠,剖腹并切开子宫,观察胚胎发育情况(计数活胎、死胎、吸收胎,计算平均活胎率,平均活胎率=活胎数/总胎数×100%)。1.5小鼠冲洗液制备开腹游离小肠,剪取幽门至回盲部小肠段,剪成约3cm小段,3mlPBS反复冲洗肠腔,收集小肠冲洗液,离心取上清,-20℃保存备用。ELISA法测定小肠冲洗液sIgA水平。1.6鼠脑的制备取孕鼠肝中叶0.2g,全胎盘,胎鼠脑,制备匀浆液,2500r/min(700×g)取上清,-20℃保存备用。ELISA检测弓形虫抗原。1.7统计分析采用SPSS13.0统计软件进行分析,孕鼠感染率、活胎率、胎盘及胚胎感染率的比较采用χ2检验,其他指标比较采用单因素方差分析。2结果2.1妊娠合并心脏病感染情况PBS组孕鼠在攻虫后第8天均出现竖毛、倦怠、腹部塌陷,饮水进食减少等异常表现,STAg组仅有少数第7-8天出现轻微竖毛、倦怠。实验期间PBS组死亡3只,STAg组死亡1只,各组死亡率无统计学差异。通过ELISA检测孕鼠肝脏弓形虫抗原,分析孕鼠感染情况发现,PBS组据妊娠前免疫时间的不同,感染率无统计学差异;STAg组感染率逐渐降低,STAg15组感染率最低,STAg组均较相应PBS组降低,但无统计学差异(P>0.05,表1)。2.2前后前末次免疫后时间PBS组各时间点小肠冲洗液sIgA水平比较无统计学差异,STAg组随着妊娠前末次免疫后时间推迟,sIgA水平逐渐升高,STAg15组高于STAg3(P<0.05)和STAg9(P>0.05)。STAg各组均高于相应PBS组,其中STAg15组明显高于PBS各组(P<0.05,见图1)。2.3妊娠合并妊娠后活胎率通过胚胎发育情况观察,发现各组均有不同程度异常妊娠发生。PBS组3个时间点间无明显差异,STAg组随着免疫后妊娠时间推迟,活胎率增加,与STAg3和STAg9比较,STAg15组最高,但差异无统计学意义(P>0.05)。STAg3、STAg9组活胎率均高于相应PBS组,但差异无统计学意义(P>0.05),STAg15组活胎率高于PBS15组(P<0.05,见表2)。2.4体外染率及胚胎和胚胎感染率PBS各组胎盘感染率和胚胎感染率差异无统计学意义,STAg组胎盘感染率和胚胎感染率均呈减少趋势,但各组间无统计学差异(P>0.05)。STAg组胎盘和胚胎感染率均低于相应各时点PBS各组,但差异无统计学意义(P>0.05)。各组胎盘感染率高于胚胎感染率,但差异无统计学意义(P>0.05,见表3)。3stag免疫的影响已有研究证实STAg滴鼻免疫可提高小鼠抵抗弓形虫感染能力。黏膜免疫应答发生的标志是sIgA的产生,sIgA是黏膜免疫反应中的保护性抗体,具有抑制外源性抗原分子的侵入、中和胞外病原微生物、结合抗原形成免疫复合物等清除病原体作用。本实验观察到,STAg滴鼻免疫提高了孕鼠小肠冲洗液sIgA特异性抗体水平,尤其是妊娠前15d免疫,抗体水平显著高于对照,并高于3d和9d免疫组。通过攻虫实验,观察到STAg免疫后孕鼠感染率均降低,妊娠前15d免疫感染率最低(P>0.05),死亡率同样降低,但差异无统计学意义,这可能是由于样本量少。殷国荣等用STAg联合霍乱毒素滴鼻免疫诱导小鼠黏膜及系统的免疫反应,且抵抗弓形虫感染。说明在妊娠前15d用STAg滴鼻免疫小鼠能有效诱导孕鼠黏膜及系统免疫应答,并提高孕鼠抗弓形虫感染能力。STAg滴鼻免疫能提高胎鼠的活胎率,降低胎盘和胚胎感染率,减少垂直传播的发生。Ismael等用Mic1-3KO免疫OF1小鼠,经检测免疫组垂直传播率为4.6%,对照组为33.3%。Ali等利用LCV-IL-2重组体免疫Swiss小鼠,可使孕鼠及胎鼠产生较强的免疫保护反应,从而减少垂直传播的发生。本研究观察到STAg免疫后提高了孕鼠的活胎率,3d(50.00%),9d(64.52%),15d(73.33%)活胎率均高于对照,15d活胎率最高。通过胎盘和胚胎弓形虫抗原的检测,STAg免疫后胎盘感染率和胚胎感染率均呈减少趋势,均低于PBS各组,但无统计学差异(P>0.05),这可能是由于样本量少的原因。但同时观察到各组胎盘的感染率高于胚胎感染率,胎盘屏障可能起到了保护作用。Romand等发现孕期感染弓形虫时,外周、胎盘、胚胎的感染率依次呈下降趋势,胎盘屏障起到了保护作