兔肺血管紧张素转换酶的分离提取

兔肺血管紧张素转换酶的分离提取

血管紧张素转换酶（ec3.4.15.1）被称为石头，是一种由单个异丙酮链组成的白糖蛋白。它在食品、医药等领域有着广泛的应用,尤其在功能性食品——降血压肽的检测方面有着不可替代的重要作用。目前,国内还没有生产ACE的厂家,进口的ACE价格极为昂贵(2000年SigmaChemicalCompany目录上ACE的价格是0.1单位为$29.8)。因此,本实验尝试一种简便、价廉的ACE分离提取方法,为进一步研究和开发降血压肽奠定基础。1材料和方法1.1药物、试剂和仪器兔肺:购于无锡市崇安寺菜市场;马尿酰组氨酰亮氨酸(Hip-His-LeuHHL):Aldrich公司;脱氧胆酸钠(进口分装):购于中国医药上海化学试剂公司;脱氧胆酸钠(国产):上海化学试剂公司;DEAE-纤维素:Pharmacia公司;SephadexG-200:Pharmacia公司;乙酸乙酯:上海化学试剂公司;核糖核酸酶:Pharmacia公司;γ-球蛋白(人类):Serva公司;牛血清白蛋白:上海明珠东风生物技术有限公司;卵清蛋白:上海生化所东风技术公司。1.2自动部分收集器及超滤器SCR20BC高速冷冻离心机:日本HITAHI公司;SBS-100数控记滴自动部分收集器:上海沪西分析仪器厂;杯式超滤器:上海亚东核级树脂有限公司;电热恒温水浴锅:北京长安科学仪器厂;烘箱:浙江嘉兴新塍电热仪器厂;台式离心机:上海安亭科学仪器厂。1.3实验方法1.3.1植物叶片活性峰的提取将体重约3～4kg的20只兔子杀死后立即取出肺,剔除结缔组织并用冰冷的0.9%氯化钠溶液冲洗,一直到冲洗液不再变红为止,而后用5倍(w/v)体积的0.02mol/L磷酸缓冲液(pH8.3)匀浆,匀浆液差速离心后获得以下三部分:P＿1为700×g离心20min的沉淀,S为700×g离心后的上清液在49000×g的条件下再离心1h的上清液,P2为49000×g离心1h的沉淀。沉淀P2溶于20倍的上述同样的缓冲液中,再加入脱氧胆酸钠均质3min,放置12h后,在49000×g的条件下再离心1h,所得上清液为所提取的ACE粗酶液。为了除去脱氧胆酸钠,用0.02mol/L磷酸缓冲液(pH8.3)透析ACE粗酶液10h,用滤纸过滤后即可上柱。将DEAE-纤维素预处理并装柱(2.5×40cm),用大量0.02mol/L的磷酸钾缓冲液(pH8.3)平衡12h,体积流量控制为80ml/h,而后将过滤后的粗酶液上柱,用1000ml的上述缓冲液洗脱,除去一些不能被DEAE-纤维素吸附的蛋白质,再用0～0.4mol/L的KCl(配制于0.02mol/L磷酸缓冲液)梯度洗脱,把具有酶活的洗脱液收集在一起,用超滤杯浓缩至8ml左右。按常规方法将SephadexG-200装柱(2.5×90cm),用0.02mol/L的磷酸钾缓冲液平衡,然后将浓缩后的酶液加入柱内,用上述缓冲液以8ml/h的流速洗脱,收集活性峰,用超滤杯浓缩。以上各个步骤均在0～10℃的条件下进行。1.3.2蛋白质的分子量本实验采用Sephedex-G200凝胶层析法测蛋白质的分子量。以细胞色素C(分子量13.7KD)、卵清蛋白(45KD)、牛血清白蛋白(67KD)、γ球蛋白(165KD)作为标准分子量蛋白质。1.3.3活性物质的测定方法ACE是一种从底物C末端专一水解二肽的酶,马尿酰组氨酰亮氨酸(Hip-His-LeuHHL)被ACE从C末端水解去除二肽His-Leu后,生成马尿酸,马尿酸的生成量可通过分光光度法测定,它的生成量直接反映ACE的酶活。另外HHL与产物马尿酸都不会被体外ACE粗提取物中的其它成分破坏,故HHL是当前测定ACE活性的最佳底物。酶活检测采用紫外分光光度法,实验在2ml的离心管中进行,每次测试的总体积为0.25ml:含0.1mol/LpH8.3磷酸缓冲液,0.3mol/L氯化钠,0.005mol/LHHL。在37℃恒温水浴5min,然后加入适量的酶液启动反应,恒温保持30min后,加入0.25ml1mol/L的盐酸终止反应,再加入1.5ml冰冷的乙酸乙酯,用力振荡混合,3500r/min离心5min后,取出1.0ml酯层转入试管中,在80～90℃的烘箱中烘1h,再将它溶入1.Oml的去离子水中,在228nm测定吸光值;空白对照值在反应前先加入0.25ml1mol/L的盐酸以终止反应外,其余操作同反应管完全相同。酶活力单位定义:1个酶活力是指在37℃的条件下,催化形成1μmol马尿酸所需要的酶量。1.3.4蛋白质试验蛋白质的测定采用福林-酚法,牛血清白蛋白作为标准蛋白。1.3.5测定了行驶容量采用苯酚-硫酸法测定ACE含糖量,以甘露糖为标准。2结果与讨论2.1ce与蛋白质含量差速离心后,P1、P2、S各部分中蛋白质和ACE的含量见表1。S中ACE的含量仅占兔肺中ACE总量的21.4%,但蛋白质含量是兔肺总蛋白质的48%,其比活力很低,P＿比活力也较低,它们均不适合进一步分离纯化;P＿2的比活力是S的6倍,其比活力较高,故作为进一步分离纯化的材料。2.2脱氧胆酸钠纯度对阿斯匹林阿斯匹林阿尼克氏原螯虾阿司克氏原螯虾阿斯塔纳,第20e-乌苏烷,ce,a.其为原料,c.其与蛋白质比例对阿斯匹林阿尼克氏的合成ACE主要存在于兔的肺泡膜上,它是一种膜蛋白。脱氧胆酸钠对膜蛋白具有增溶作用,它的纯度以及它与蛋白质的比例对ACE的比活力有很大的影响(见表2),国产脱氧胆酸钠由于纯度较低,其中的某些杂质会使ACE变性,从而影响纯化的效果。蛋白质与进口脱氧胆酸钠比例为3:1时,达到最大增溶效果。2.3酶活力的分离ACE粗液通过DEAE-纤维素柱梯度洗脱后,得到三个峰(见图1),经活性测定表明:第一个峰具有酶活力,其氯化钾浓度在0.04～0.1mol/L范围之间。将上述具有酶活力的洗脱液浓缩为8ml,经SephadexG-200层析时,上样量为1.5ml,得到两个蛋白峰(见图2),其中第二个蛋白峰具有酶活力。当上样量大于1.5ml时,ACE不能得到良好的分离。通过以上一系列的分离提纯,ACE的比活力增加了65.8倍,ACE的比活力达到12.3U/mg(见表3)。2.4测定了行驶容量通过苯酚-硫酸法测得兔肺ACE中糖含量为19.3%(质量百分比)。2.5异质分子中ce含量的测定以四种标准蛋白质分配系数(Kav)和分子量的对数绘制标准曲线(如图3)。根据ACE的最大活力峰Kav为0.0878,求得ACE的分子量为302KD,这比文献报道兔肺中ACE的分子量(300KD)稍大,这是由于分离提取的ACE的含糖量为19.3%,利用凝胶层析法测蛋白质的分子量时,当含糖量大于5%时,测得分子量值偏高。2.6最佳ph的确定以HHL为底物,在37℃测定不同pH时ACE的活力,可知ACE的最适pH为8.3。用不同的pH的缓冲液与ACE液于4℃放置24h,然后测定酶的残余活力,结果表明ACE在pH7～10间稳定性较高。2.7反应温度对酶活力的影响在pH8.3的缓冲液中,ACE与底物HHL在不同温度下进行酶促反应后测定酶活力,结果表明酶活力随反应温度的升高而上升,酶的最适反应温度为37℃,当温度超过37℃时,酶活力急剧下降。将酶和上述缓冲液在不同温度下保温60min后,测定残余酶活力,结果表明ACE对温度较敏感,在25℃以