奥硝唑悬液诱导的左旋肉碱与精子质量的关系

奥硝唑悬液诱导的左旋肉碱与精子质量的关系

氨基溶胶是甲基硝唑和硝基咪唑之后的第三代硝基溶胶衍生物。它对抗厌氧菌和原生质（如滴虫）的感染起到了很好的作用。可广泛用于治疗由厌氧菌、阿米巴原虫贾滴虫、毛滴虫等感染引起的各种疾病。近年来研究显示,奥硝唑对雄性大鼠生殖系统具有可逆性的毒性影响,可以降低大鼠的生育能力。左旋肉碱(carnitine)又称L-肉碱,是人体内长链脂肪酸代谢产生能量所必需的一种物质,研究认为,附睾中的L-肉碱与精子成熟、运动能力的获得密切相关。因此本研究以奥硝唑建立弱精子症大鼠模型,观察L-肉碱对弱精子症大鼠精子质量的影响,探讨大鼠精子质量与附睾L-肉碱的相关性,为L-肉碱用于男性不育临床治疗提供实验依据。材料和方法一、研究主题雄性SD大鼠,体重180～220g,由北京大学医学部实验动物部提供。二、仪器、试剂与标准材料L-肉碱和奥硝唑分别由东北制药总厂和西安博华制药公司提供;L-肉碱用无菌生理盐水溶解,奥硝唑用0.5%的羟甲基纤维素钠(CMC-Na)配制,均为每日新鲜配制。使用的仪器有水浴箱及离心机(北京医疗器械厂)和光学显微镜(Olympus)。附睾中肉碱测定采用Agilent6400系列三重四极串联液/质联用仪(美国Agilent公司),以Masshunter色谱数据工作站进行数据采集及计算。L-肉碱(纯度:98%)标准品购于Sigma公司,衍生试剂购于日本东京化成株式会社。实验中所用乙腈、甲醇为色谱纯级试剂,其余试剂为分析纯级试剂,试验用水均为超纯水。三、奥硝唑悬液对b组的影响将雄性SD大鼠按灌胃药的不同随机分为3组,A组、B组和C组,每组8只。A组(对照组):0.5%CMC-Na;B组:400mg/kg奥硝唑悬液;C组:400mg/Kg奥硝唑悬液+100mg/kgL-肉碱。各实验组每次分别给予相应剂量的药物,连续灌胃给药20d。四、测量指标和检验方法(一)附睾丸精子活力分级末次给药后的24h,用戊巴比妥钠麻醉大鼠,剪开阴囊,取一侧附睾尾部,称其重量,置于生理盐水中(37℃保温箱中)剪碎,温育片刻,待附睾精子充分游离后,用精子计数板检测精子密度,并进行精子活力分级检测。(二)大鼠精子畸形试验吸取悬液滴于清洁载玻片上,作均匀推片后用无水乙醇固定,2%伊红水溶液染色30min,高倍镜下每只大鼠检查200个完整的精子,记录正常、无钩、胖头、断头、双尾、尾折叠和断尾精子数。(三)蛋白沉淀剂乙腈的制备将余组织制成匀浆取200μl,加入蛋白沉淀剂(乙腈:水,1:1)400μl,在4℃下12000r/min离心15min后迅速取上清500ul,再加入蛋白沉淀剂(乙腈:水,1:1)400μl,重复操作1次,取上清20μl进样待测。五、比较分析方法用SPSS13.0统计软件进行数据分析,检测结果以表示,组间差异的比较用LSD法进行,相关性分析采用Pearson相关系数法并进行显著性检验。P<0.05为差异有统计学意义。结果一、精子活力和精子形态正常率如表1所示,A组、B组及C组精子密度差异无统计学意义(P>0.05);A组、C组精子活力和精子形态正常率明显高于B组(P<0.05),A组与C组精子活力和精子形态正常率差异无统计学意义,A组、C组附睾总L-肉碱及游离L-肉碱浓度明显高于B组(P<0.05),A组与C组精浆总L-肉碱及游离L-肉碱浓度比较差异无统计学意义。二、l-肉碱在附睾丸中的作用机制表2显示,精子密度与附睾总L-肉碱、游离L-肉碱浓度的相关性无统计学意义;精子活力与附睾总L-肉碱、游离L-肉碱浓度呈正相关(r=0.645,P<0.05;r=0.676,P<0.05),精子形态与附睾总L-肉碱、游离L-肉碱浓度呈正相关(r=0.557,P<0.05;r=0.583,P<0.05),相关性具有统计学意义。本实验以奥硝唑建立弱精子症大鼠模型,并对精子质量及附睾中肉碱浓度进行了检测。研究显示奥硝唑连续给药20d,大鼠的精子密度改变不明显,精子活力和精子形态正常率显著下降,附睾总肉碱及游离肉碱浓度显著降低,提示奥硝唑对睾丸的影响不明显。据文献报道,奥硝唑对附睾中精子的作用,主要是干扰精子成熟和运动所必须的的糖酵解酶,使精子获取能量过程受阻,从而降低了精子的活率与活力。同时考虑到奥硝唑抗微生物的机制,它还有可能是通过其分子中的硝基在无氧环境中还原成氨基或通过自由基的形成,与细胞成分相互作用,从而导致精子结构受损,引发动物生殖功能的降低。另外,奥硝唑可能作用于肝脏,使肝脏合成肉碱的能力降低,从而使得附睾液中肉碱水平降低,也可能影响了附睾的吸收功能,干扰其对肉碱的主动摄取。L-肉碱的主要功能是促进脂类代谢,加快缺血缺氧组织堆积的脂酰辅酶A进入线粒体内,减少其对腺嘌呤核苷酸转位酶的抑制,从而使氧化磷酸化顺利进行。附睾是L-肉碱高分布脏器,附睾本身不能产生L-肉碱,其来源主要来自于血浆,附睾对血浆中L-肉碱的摄取过程是一个主动摄取过程。脂类氧化是精子获得能量的一种主要来源,而精浆中L-肉碱在脂类的氧化代谢过程中起着重要的作用。L-肉碱存在于线粒体内膜中,是线粒体膜上唯一的活化脂肪酸的载体,其主要功能是携带、转运活化的脂肪酸,为体内各种代谢过程,包括精子的成熟和代谢过程提供能量。在男性和雄性动物的生殖道,L-肉碱高浓度地集中于附睾,并主要以游离态形式存在。附睾本身不具有合成L-肉碱的功能,其对L-肉碱的摄取来自于血浆,但L-肉碱在附睾中的浓度却远远高于血浆中水平,以保证精子代谢和成熟过程中对能量的需求。有研究表明,L-肉碱参与精子能量代谢、降低精浆中活性氧物质(reactiveoxygenspecies,ROS)、稳定精子细胞膜、抗精子凋亡,它能将原本不能自由穿越线粒体膜的长链脂肪酸,从线粒体外的活化位点转运到线粒体基质内的氧化位点,完成β-氧化和三羧酸循环,产生三磷酸腺苷,为精子提供能量,促进和调节精子的发育成熟。当精子到达附睾尾部时,已经成熟并且具备了授精能力。附睾头部较低浓度的L-肉碱可以刺激大鼠精子的运动能力,而附睾尾部高浓度的L-肉碱抑制精子对O2的摄取,使精子保持在静息状态。刘清珍等报道L-肉碱可保护大鼠生殖系统对抗奥硝唑所致的氧化损伤,对大鼠生殖功能具有一定的保护作用,临床上已经将L-肉碱作为治疗男性不育的药物广泛应用。本研究结果显示,弱精子症大鼠的附睾总L-肉碱及游离L-肉碱浓度明显低于对照组和补充肉碱组,精子密度与附睪总L-肉碱、游离L-肉碱浓度的相关性无统计学意义；精子活力与附睾总L-肉碱、游离L-肉