水稻组织培养研究进展

水稻组织培养研究进展

集体培训技术是农业高科技中最重要、最活跃的领域之一。它不仅是农业可持续发展的基础，也是生物技术应用最广泛、最现实的领域。被称为农业史上的“第四次绿色革命”，对解决经济和社会发展面临的人口增长、农业资源贫寒、环境保护等重大问题具有重要的战略意义。进行植物组织培养,只需要少量的材料就能获得大量的植株,不仅可节约大量种子、肥料,而且还节约了大量的耕地,目前组织培养技术已被广泛应用于水稻、兰花、月季、芦荟、马铃薯等植物的工厂化生产中,并取得了巨大的经济和社会效益。本文从影响水稻组织培养的各种因素及其应用等方面对近年来的研究进行综述,以便给相关研究者提供参考。1影响水稻集体培训的因素1.1种外植体间的愈伤组织诱导率和绿苗分化率外植体是指植物组织培养中用来进行离体无菌培养的材料,如器官、组织、细胞和原生质等。水稻不同外植体的组织培养效果好坏对水稻育种有很大的影响。目前我国水稻育种仍处于以传统手段为主的阶段,即采用两亲本杂交,然后通过系谱法来选择优良后代,后代性状依旧接近于两亲本,变异来源较窄。近年来随着生物技术手段的不断发展,组织培养技术已经广泛应用于水稻育种中,然而目前多数育种单位选用的都是花药培养结合常规手段。事实上,采用不同外植体进行组织培养都能够获取更多的变异,但是选用哪种外植体的绿苗分化率最高且最易获取有利变异目前还未见报道。在水稻不同外植体的组织培养研究中,目前研究最多的为花药、幼穗、幼胚、成熟胚等4种外植体,但是不同品种、不同外植体之间愈伤组织诱导率、绿苗分化率都有较大的差异。郑文静等研究表明,4种外植体中以成熟胚为外植体时诱愈率最高,幼胚和幼穗为外植体诱愈率次之,取花药为外植体时杂交组合的诱愈率比常规品种稍高,除辽粳294外都在10%以内。在对组织培养后代的变异率调查中发现,以成熟胚为外植体的后代有利变异率最高,花药培养次之。王秀红等对于水稻不同基因型不同外植体培养效果及其相关性分析研究表明,幼穗、幼胚和成熟胚的愈伤组织诱导率均显著高于花药的愈伤组织诱导率;幼穗和幼胚绿苗分化率差异不显著,但均显著高于成熟胚和花药,成熟胚的绿苗分化率也显著高于花药。对同一基因型不同外植体间的愈伤组织诱导率和绿苗分化率分别进行相关性分析,结果表明,花药与幼穗、成熟胚的愈伤组织诱导率存在显著正相关,幼穗和幼胚的愈伤组织诱导率也存在极显著正相关。不同外植体的绿苗分化率之间不存在相关性,愈伤组织诱导率和绿苗分化率不存在显著的相关性。姜大刚等以我国特有的温敏不育系籼稻品种安农S-1及其转育的不育系安湘S和香125S为材料,对不同外植体愈伤组织进行研究,在所选用的3个水稻品种中,成熟胚的愈伤组织诱导率均在90%以上,而且诱导的愈伤组织性状较好;而以幼胚为外植体诱导愈伤组织时,香125S的诱导率明显高于安农S-1和安湘S。胚性愈伤组织的继代成功率,不论对于幼胚还是成熟胚来说,香125S都明显高于安农S-1和安湘S。可见水稻品种不同,其外植体的诱导率也有差异。1.2不同消毒剂对愈伤组织诱导率的影响外植体在接种之前,须经严格灭菌。目前外植体灭菌多采用酒精和氯化汞,其中酒精具有较强的杀菌力、穿透力和湿润作用。酒精和氯化汞处理的时间过长或过短都不利于灭菌,过短灭菌不彻底,过长虽然污染率降低但也会影响愈伤组织诱导率,所以应严格把握灭菌的时间。灭菌组合方式一般有:(1)70%酒精消毒3min,再用0.1%氯化汞消毒15～18min,最后用无菌水洗净;(2)70%酒精浸泡种子1min,然后用2.5%NaClO浸泡20～30min,用无菌水冲洗种子4～5次,并浸泡过夜;(3)将水稻种子去壳后用70%酒精消毒1min,再用体积比为1∶1的0.1%氯化汞和2%NaClO的混合消毒液浸泡20min,最后用无菌水冲洗3～5遍,用滤纸吸去多余的水分。1.3分离培养基对愈伤组织的诱导通常以M8、N6、MS、AA、1/2MS为水稻组织培养的基本培养基。其中1/2MS主要用于生根培养,AA主要用于水稻悬浮细胞培养。NB和NMB是目前水稻转化培养中最常用的组合培养基,刘香玲等的研究表明,这2种培养基各有利弊,把NB和NMB组合起来使用比单独使用效果更好,诱导的胚性愈伤组织更多且胚性强、生长和分裂旺盛、分化率高。此外在基本培养基中添加一些物质对其进行改良,如改良型M8培养基,也显现出了良好的应用效果。冯双华等在对不同因素对水稻温敏核不育系香125S花药培养影响的研究中引用了改良M8培养基,结果发现其愈伤组织诱导率显著高于N6和M8,利用改良M8培养基诱导的愈伤组织,平均绿苗产量也显著高于利用M8和N6,不同培养基对花药愈伤组织诱导效果有显著差异,表现为改良M8>M8>N6。张智奇等利用2种培养基N6和MS对水稻幼穗进行愈伤组织诱导,经过继代培养原生质体游离,最终都形成了再生植株,但基本培养基N6比MS更为有效地促进植株再生而得到白化苗。张尧忠等的研究结果也表明,N6分化培养基的再生绿苗率极显著高于MS培养基。这说明,在利用水稻器官进行愈伤组织诱导时,N6培养基是较好的选择。为了提高培养效果,又有研究人员对N6培养基进行进一步完善和改良。徐明良等在N6培养基中加入2μg/L2,4-D,结果悬浮细胞和原生质体都获得了高频分裂;吴家道等利用N6培养基的大量元素、MS培养基的微量元素和B5有机物显著提高了原生质体培养的植板率。李良材等在进行水稻悬浮细胞的培养时发现,在AA培养基中加入一定浓度的ABA有利于原生质体的存活和分裂。愈伤组织的继代能力是水稻离体培养再生体系必须考虑的重要方面,与来源于幼胚、幼穗的愈伤组织相比,来源于成熟胚的愈伤组织继代更难。外源生长素是继代培养基中必不可少的成分,2,4-D是首选的激素种类,但是不同的品种对浓度有不同的要求。蔗糖是水稻组织培养最基本和最常用的碳源。研究表明,不同的外植体诱导愈伤组织需要添加的蔗糖浓度不同,如成熟胚为30g/L、幼穗为40g/L、花粉为60g/L等。李霞等对不同浓度蔗糖对成熟胚的成愈率和质量的影响研究表明,适当增大蔗糖浓度可以提高成熟胚的出愈率,并且提高愈伤组织质量,但60g/L则会明显降低出愈率,影响愈伤组织质量。另外在诱导培养基中加入毒素对幼胚的筛选有较好效果,可以获得较多的胚性愈伤组织和较多的分化苗。培养基中毒素的处理浓度以30%效果最好。维持培养基中的渗透压对愈伤组织的质量有十分重要的作用。通常使用不同浓度的山梨醇或甘露醇等物质来提高胚性细胞诱导及保持培养基渗透压;但如果使用浓度不当很容易使组织褐化或死亡,而通过提高诱导培养基的蔗糖浓度(50g/L),可增加碳源并调控渗透压、提高诱导率,一举多得。杨跃生认为培养基中的Cu2+含量对植株的再生有明显影响。也有报道选择不同植物生长调节物质处理和高浓度琼脂粉固体分化培养添加TDZ、甘露醇、亚精胺及脱水处理和两步分化法等可提高水稻愈伤组织成苗率。此外,在分化培养基中添加适量Na2SiO3,可明显提高水稻愈伤组织成苗率。1.4外源激素对愈伤组织生长的影响水稻组织培养中,影响因素是多方面的,而激素是影响愈伤组织诱导和绿苗分化的关键性因素。目前水稻愈伤组织的诱导使用最多的激素是2,4-D。李玉静等研究表明,2,4-D是诱导愈伤组织必不可少的因子,其与6-BA配合使用对种胚愈伤组织的诱导效果不同。从愈伤组织诱导率上看,2.0mg/L2,4-D与0.5mg/L6-BA配合诱导率最高,4.0mg/L2,4-D与0.2mg/L6-BA配合诱导率最低,2.0mg/L2,4-D与6-BA配合的种胚愈伤组织诱导率较大,因此可以认为2.0mg/L的2,4-D比较适合于种胚愈伤组织诱导,这也与大多数有关报道相似。如果诱导愈伤组织在使用了2,4-D的基础上再添加ABA、6-BA、KT等激素,则对籼稻的成愈率、愈伤组织质量和胚性有明显作用,可获得较高的诱导率,而对粳稻的愈伤组织的诱导作用不大,可见不同的基因型对激素的敏感性不同。6-BA是一种活性较强的细胞分裂素,在植物组织培养中的主要功能是促进细胞的分裂和芽的形成,可以提高花粉胚状体的产生和增强形成根的趋势,对分化成苗起主导作用。ABA目前被认为对诱导愈伤组织及保持愈伤组织胚性有一定作用,特别对籼稻的作用更明显。各类植物激素的生理作用虽有相对专一性,但是植物的各种生理效应是不同种类激素之间相互作用的综合表现,植物细胞离体培养、诱导脱分化和再分化过程更非某类激素单独作用的结果。王冬梅等研究表明,2,4-D和6-BA是诱导分生愈伤组织、胚胎细胞和胚状体所必需的因素;但在诱导过程中,2,4-D浓度应逐步降低,否则愈伤组织细胞不能成为胚胎细胞,而提前分化生根表明组织培养中生长素含量过高不利于胚胎发生。6-BA有协同生长素的性质,但不直接参与胚胎发生。胚状体产生后2,4-D和6-BA则抑制其进一步发育,这可能与胚产生内源激素有关。田文忠发现,添加2mg/L2,4-D的诱导培养基上生长的愈伤组织比较松软,呈黏液化和泡泡状,一般不易分化,转移到再生培养基中后,仅能得到10%以下的再生频率;但在诱导培养基和继代培养基上添加NAA和KT后,可以改进愈伤组织的质量,从外形上看,愈伤组织比较致密、较硬、颗粒状结构、易于分化,可以提高籼稻的再生频率。在进行水稻组织培养时,籼稻比粳稻要求更高的激素水平,培养液中添加的外源激素的种类和含量对愈伤组织质量有影响,因此水稻愈伤组织的培养是受内源激素和外源激素共同影响的。各内源激素在水稻遗传转化过程中有着不同的作用:IAA主要存在于愈伤组织的芽中,而剥离后的种胚中较少,且过高的IAA不利于愈伤组织的诱导和生长,可以通过ABA来消除它的不利影响;ZR主要存在于诱导愈伤组织的种胚中,有促进分裂和生长的作用,对愈伤组织诱导时的启动有决定作用,如果外植体的ZR含量太低,即使有较高的IAA也不能诱导出愈伤组织,在抗性筛选后籼稻愈伤组织中ZR含量偏低可能是造成籼稻转化率不高的原因之一。过高的ABA对愈伤组织的诱导不利,但在继代培养基中适量提高ABA浓度有利于胚性愈伤组织的形成。ABA对胚胎愈伤组织的发生有良好的作用,可以增加愈伤组织的致密度和分生细胞的数目,且有利于愈伤组织的诱导和再生能力的保持,降低分化过程中的发芽率。体细胞的发生受外源ABA与内源ABA共同调节,在ABA浓度适宜时,能抑制多种异常体细胞胚的发生,而且外源ABA加入培养基的时间愈早其效应愈显著。ABA能诱导乙烯生成,而乙烯对愈伤组织细胞有伤害作用。因此,在培养基中附加ABA的时间不能过长,通常为1～2周。愈伤组织分化时较高的ABA/IAA比值有利于芽的形成。1.5不同处理对水稻愈伤组织再生的影响干燥处理、低温处理、光处理、非植物激素类化学试剂处理均能有效促进水稻愈伤组织绿苗分化。干燥处理能促进水稻愈伤组织对矿质元素的吸收,影响过氧化物酶(POX)基因表达,降低脯氨酸含量。谭光轩等认为干燥处理可能引起愈伤组织mRNA的代谢和POX活性升高,从而降低水溶性蛋白、吲哚乙酸水平,影响愈伤组织胚状体发育进程,提高野生稻绿苗分化率;王春艳等认为高温会加速分化能力的衰减,适当降低培养温度有利于愈伤组织保存和胚性保持;愈伤组织的分化采用“先暗后光”的方法,即愈伤组织适应低生长素、高细胞分裂素的分化培养条件并开始生长之后,每天给予14h1000～2000lx的光照,结果愈伤组织老化率减小,再生植株频率提高了7.5倍;培养基中以淀粉代替琼脂,即用0.2%琼脂+2.0%水稻或小麦淀粉可促进出愈率,这可能是因为培养基表面有一薄层液体,使水稻充分吸收培养基的养分和水,但又不会下沉,有良好的透气性。另外培养基中的淀粉在水稻淀粉酶作用下分解成可利用的碳源。降低分化培养基中蔗糖的含量,加入适量山梨醇可明显提高水稻愈伤组织的再生植株频率,多个品种分化频率均在75%以上。此外低浓度的二甲塞亚巩对植株再生有促进作用,但品种间存在差异。长期继代培养引起愈伤组织再生能力衰退的问题已被很多学者所认识和重视,针对其衰退的原因也有比较深入的生理生化研究。郑贵朝等在研究中采用脱水处理、添加亚精胺、Cu2+或山梨醇等能在某种程度上恢复愈伤组织的再生能力。愈伤组织的再生培养一般是使用含有BA和NAA的培养基直接获得植株,然而这个方法在很多情况下培养效率不高。为了解决这个问题,有学者研究并报道了在诱导植株再分化的培养之前,在继代培养中添加山梨醇或甘露醇或在分化培养基中加入亚精胺能提高愈伤组织的再分化能力;杨跃生等也报道了创造良好的通气条件、对愈伤组织进行适度的脱水处理和添加较高浓度Cu2+的方法,其中以添加Cu2+的处理最为方便,并适合于组培的每个环节。袁云香等的研究表明,采用三步分化法的出愈率和成苗率均高于两步分化法和直接分化法。此外,酚类物质是水稻愈伤组织褐化的主要原因,减少酚类物质也能改善愈伤组织质地及提高分化率。近年来有研究表明,钙处理对愈伤组织的生长及分化有较大的影响;钙可以诱导烟草外植体的分化、开花和生根。适当增大培养基中的钙浓度可提高水稻愈伤组织的相对生长量、分化率、再生植株生根条数及根长。2研究和开发水稻组织2.1水稻花药培养及生化材料的制备水稻单倍体在遗传上具有无显隐性、易表达、加倍后即纯合等优势。对水稻单倍体的诱导,特别在利用方面进行了很多研究。在生物技术领域,花药培养被公认为能最早转化为生产力,在品种改良上发挥作用并产生重要影响度的技术。据不完全统计,自从1975年审定第一个花培品种单丰1号以来,全国已有20多个花培品种通过审定。但籼稻品种较少,主要是由于籼稻花药培养率很低。杨长登等以籼稻单倍体无性系微芽为材料进行愈伤组织的诱导、分化,扩增微芽后,用秋水仙素浸泡48h放在分化培养基上长苗,获得二倍体,微芽经过愈伤组织后自然加倍率达74%。郭秀平等用同源四倍体水稻种质资源为材料,通过水稻花药培养的减倍,得到新种质高频系A87203,该材料1个芽丛培养1个月,芽数可增殖150～200倍,高的可达350倍以上。沈圣泉等对引进的中籼品系3027进行射线诱变处理,而后结合幼穗培养,从诱发产生的变异后代中成功选育优异恢复系突变体R3027,配制出强优势杂交水稻新组合,展现了良好的应用前景。2.2成熟种子诱导愈伤组织的诱导表达稻瘟病是水稻的主要病害之一。稻瘟病菌在代谢过程中产生致病毒素,用粗毒素接种可产生与病原菌侵染相同或类似的病症。原因是毒素在生理浓度范围内会干扰植物的生理功能。水稻白叶枯病是水稻最主要的三大病害之一,在我国稻区每年都有不同程度的危害。赵海岩等用水稻成熟胚、花药作外植体获得愈伤组织,在培养基上加稻瘟病菌粗毒素提取液继代培养,将较强活力的愈伤组织转到含稻瘟病菌粗毒素提取液的分化培养基上光照培养,田间接种鉴定和天然疫圃种植鉴定,获得了2个抗性得以提高的稳定品系辽农2号和辽农7号,抗病性较原品种提高了1～3个等级。王莉江等用明恢63的成熟种子诱导愈伤组织,利用基因枪辅助的土壤农杆菌转化法将天花粉蛋白基因转入明恢63的愈伤组织,并通过再生获得了转基因