星点设计-效应面法优化连钱草总黄酮提取工艺

星点设计-效应面法优化连钱草总黄酮提取工艺

本实验与紫外分光光度法相结合，利用效应优化法（srm）对连银草中总黄酮进行了优化，并采用了非线性数学模型调整方法，将自变量与因变量的关系扩展到曲线，使实验数据更加准确，比传统的正交分析法更可靠。1材料表面1.1仪器UV-752型紫外-可见分光光度计;FA-1104型电子分析天平;KH-500B型超声波清洗仪;FW100型高速万能粉碎机。1.2其他试剂鉴定芦丁对照品(中国药品生物制品检定所,批号:080-9303);水为蒸馏水;其他试剂均为分析纯。连钱草药材,采于江苏及其周边地区,经南京中医药大学中药系药用植物教研室炮制教研室巢建国教授鉴定为唇形科植物活血丹Glechomalongituba(Nakai)Kupr.的地上部分。粉碎,备用。2方法和结果2.1对照品溶液的制备精密称取芦丁对照品22.85mg,置于100mL量瓶中,加甲醇约60mL,密塞,超声使其溶解,放冷,加甲醇至刻度,摇匀,得芦丁对照品溶液(即每mL溶液中含芦丁对照品为0.2285mg)。2.2超声提取法取连钱草粉末约0.5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入55%甲醇40mL,密塞,称定质量,室温下超声提取(功率250W,100kHz)90min,放冷,补足减失的质量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。2.3紫外-可见分光光度法分别精密吸取上述供试品溶液2mL和芦丁对照品溶液2mL,置25mL量瓶中,加水至6mL,加5%亚硝酸钠溶液1mL,摇匀,放置6min,加10%硝酸铝溶液1mL,摇匀,放置6min,加入氢氧化钠试液10mL,再加水至刻度,摇匀,放置15min,分别作为供试品溶液和对照品溶液,并以相应的试剂为空白,照紫外-可见分光光度法(《中华人民共和国药典》2010年版一部附录VA),于200～800nm扫描,结果在510nm处有最大吸收,故以510nm为测定波长。2.4方法研究2.4.1标准曲线的绘制精密量取上述芦丁对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL,分别置于25mL量瓶中,各加水至6mL,加5%亚硝酸钠溶液1mL,摇匀,放置6min,加10%硝酸铝溶液1mL,摇匀,放置6min,加入氢氧化钠试液10mL,再加水至刻度,摇匀,放置15min,以相应的试剂为空白,在510nm处测定吸光度,以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标绘制标准曲线,得回归方程:A=11.27C+0.001(r=0.9995),式中A代表吸光度,C代表对照品浓度(mg/mL),对照品浓度在0.00914～0.05484mg/mL范围内呈良好的线性关系。2.4.2测定的精密度试验取浓度为0.03656mg/mL的对照品溶液,连续测定6次,对照品溶液吸光度平均值为0.416,RSD为0.13%,表明测定方法的精密度良好。2.4.3供试品溶液稳定性精密吸取同一份供试品溶液2mL,置于25mL量瓶中,照2.4.1项下的显色方法处理样品,于510nm测定吸光度,每间隔5min测定1次,在30min内,吸光度平均值为0.423,RSD为0.81%,说明供试品溶液在30min内显色稳定。2.4.4重复性测定结果取同一批次连钱草粉末,制得6份供试品溶液,于510nm依法测定吸光度并计算出连钱草中总黄酮的平均含量为36.49mg/g,RSD为1.12%,表明该方法的重复性良好。2.4.5加样回收及加样回收率取已知含量连钱草粉末6份,每份约0.2g,精密称定,分别置于锥形瓶中,各加入新鲜配制的芦丁对照品溶液(浓度为1.425mg/mL)5mL,按2.2项下供试品溶液的制备方法制备样品,于510nm处依法测定吸光度,计算加样回收率,结果平均加样回收率为99.32%,RSD为2.38%。2.5sd-sd-优化了总黄酮提取工艺，包括金草中的总黄酮2.5.1提取溶剂的选择按2.2项下供试品溶液的制备方法提取连钱草中总黄酮,其中影响提取效果的可能因素较多。为了便于操作和保证实验精度,以连钱草总黄酮的含量为指标,采用单因素试验,比较了超声法、加热回流法及渗漉法的提取效率和操作步骤的繁易程度,最后决定采用超声提取法;在溶剂的选用上,水、甲醇、乙醇均是提取黄酮类成分的常用溶剂,尤其是甲醇,提取效果较佳。(本实验从验证星点设计实验的准确性出发,故而选之,并未考虑到工业化生产,可以考虑用乙醇做替代实验。)进而分别对甲醇的浓度(40%、50%、60%、70%、80%、90%),超声提取的时间(20、40、60、120、180min),超声次数(1、2、3、4次)以及溶剂的用量(30、40、50mL)这些因素进行了考察。实验发现,60%的甲醇具有最佳提取效果,超声时间在60min及120min时提取总黄酮含量最多,溶剂的用量以40mL为宜,其他因素的影响作用较弱,暂不予考虑。2.5.2次多项式拟合根据单因素考察结果,选择提取工艺中对总黄酮含量有影响的3个主要因素为考察对象,即甲醇浓度(X1)、超声时间(X2)及溶剂用量(X3),同时以连钱草中总黄酮的含量(Y)为评价指标。根据CCD的原理,每个因素取5个水平,因素和水平见表1,实验设计及结果见表2。以连钱草中总黄酮的含量(Y)为因变量,使用Statistica7.0软件,分别对X1,X2,X3进行多元线性回归和二次多项式回归拟合,结果如下:多元线性回归方程:Y=46.99918-0.36283X1+0.03892X2+0.010319X3,r=0.9217;二元多项式方程:Y=-12.2371+1.2193X1-0.0104X12+0.0561X2-0.0003X22+0.6006X3-0.0053X32-0.0007X1X2-0.0045X1X3+0.0020X2X3,r=0.9829。由结果可知,二次多项式拟合的相关系数优于多元线性回归方程,因此本实验以二次多项式为其数学模型。由于三维图只能表示效应对其中2个因素的关系,为了考察各因素对指标的影响,先固定一个对应变量影响最小的自变量,观察可知,X3对应变量Y的影响最小,一般设其值为中值,因此,选择X3为40,代入二次多项式方程,绘制因变量Y对X1(甲醇浓度)和X2(超声时间)的3D效应面图(A)和等高线图(B),见图1。根据以上效应面图和等高线图直观分析,当溶剂用量(X3)一定时,甲醇浓度(X1)在40%～60%之间,超声时间(X2)在80～150min时连钱草中总黄酮的提取含量达到最大。2.6预测结果的验证根据得到的最优条件,结合单因素考察结果和实际可操作性,确定连钱草总黄酮的最优提取条件为:甲醇浓度为55%,超声时间为90min,溶剂用量为药材量的8倍(本实验为40mL),代入二项式方程得到连钱草总黄酮含量的预测值为35.36mg/g。在此条件下提取连钱草药材,依法测定其总黄酮含量,对预测结果进行验证。结果显示,3批连钱草药材总黄酮的平均含量为35.66mg/g,预测值与实际值之间偏差较小,本实验确定的最佳提取工艺条件合理,且具有较好的稳定性和重现性。3系统成分筛选实验目前国内多采用单因素考察或正交设计法优化中药有效成分的提取纯化等工艺,虽然以上方法较为简便,但精度不高,而且大多情况下,各因素对效应的影响并非线性,实验数据没有可靠的预测性。就传统的正交设计法而言,虽然实验次数较少,但由于因素之间交叉的不够全面而导致实验结果与单纯的单因素考察结果存在偏差。本实验采用CCD