连钱草提取物体外溶石作用的实验研究

连钱草提取物体外溶石作用的实验研究

连草是嘴唇科植物的活血丹glechoma（nakai）kubre，干燥的土壤。在《本草纲目》和《中医词典》中被称为金钱草，在江苏省的地方药物中也被用作金钱草来治疗肝石细胞。中国药典1977年版将报春花科植物过路黄LysimachiachristinaeHance.收载为正品金钱草,而连钱草则被单独收载,功能主治为清热解毒、利尿排石、散瘀消肿,用于尿路结石,肝胆结石,湿热黄疸,跌扑损伤。但以后的各版药典功能主治再没有明确收载治疗肝胆结石之功效。德国用同属植物欧活血丹(GlechomahederaceaL.)提取物制成的成药爱活胆通,用于早期胆固醇性结石及孤立性、混合性以胆固醇为主的胆结石,取得良好效果。有文献报导,连钱草与欧活血丹化学成分与疗效均较相似。因此,连钱草是否具有治疗肝胆结石的功效值得探讨。1材料表面1.1胆固醇型结石自提连钱草提取物(水提取物WE;乙醇提取物EE;乙酸乙酯提取物EA);阳性对照药;爱活胆通,德国汉堡大药厂,批号:08591;熊去氧胆酸片,上海三维制药有限公司,批号:20060501,临床上均主要是用于胆固醇型结石的治疗。乌拉坦,上海润捷化学试剂有限公司,批号:050829;磷脂以改良抗坏血酸还原法测定;其它均用试剂盒以分光光度法测定。1.2syxk苏健康英国短毛豚鼠60只(购自南京安立默科技有限公司,许可证号:SYXK(苏)2002-0017),体重250g左右,雌性。1.3鱼粉、麸皮、猪肉、培养基配方:玉米粉15%,黄豆粉10%,面粉10%,鱼粉3%,麸皮10%,食盐1%,酵母粉1%,苜蓿粉40%,酪蛋白2%,猪油2%,蔗糖5%,胆固醇1%。1.4石人体胆固醇结石实验样本,由安徽省武警医院提供,并经醋酸酐法定性后洗净,50℃真空干燥保存,备用。1.5日本德国UV-1700型紫外分光光度计(日本岛津公司);AR1140电子天平(德国赛多利斯公司);DZG-6050真空干燥箱(上海申信实验仪器有限公司)。2外溶石实验2.1u3000加入不同剂量的药剂取清洁具塞试管40支,每组8支,将已用紫外灯灭菌并称量的结石1粒装入孔径0.8mm的尼龙网袋中,浸入盛有5ml各种药液的试管室温静置,第一组至第三组分别为EE组、EA组、WE组,按0.5g/ml的浓度加入。每两天换新鲜的药液一次;第四组为熊去氧胆酸片组,每次加入饱和的熊去氧胆酸溶液;第五组为空白对照组,每次加入生理盐水;分别在加药的第15天、第30天、第45天取出结石减压干燥,精密称定,比较各给药组与生理盐水组有无显著性差异,结果见表1。2.2各组溶石作用的比较由表1可见,第15天,连钱草各提取液、熊去氧胆酸组与生理盐水组比较,均有溶石作用(EE组P<0.01;其它各组P<0.05),EE组溶石作用比阳性对照组强(P<0.05);第30和45天,连钱草各提取液、熊去氧胆酸组与生理盐水组比较,均有溶石作用(P<0.01),EE组溶石作比阳性对照组强(P<0.05)。表明连钱草提取物对人胆固醇结石有明显的体外溶解作用,脂溶性提取物较水溶性提取物溶石作用强。3内溶石实验3.1方法和步骤3.1.1各组ea、醇提组、乙酸乙酯组ea、压提法豚鼠随机分为6组,即空白组、模型组、阳性对照组、水提组(WE)、醇提组(EE)、乙酸乙酯组(EA),每组10只,室温,自然光照。空白组每日喂养普通饲料、模型组和其它各组投以成石饲料七周,每笼每日投250g,自由饮水。3.1.2爱活胆通的制备七周后,空白组正常饲养,其余各组灌胃给药,模型组给予1ml生理盐水,对照组给爱活胆通(0.066g/kg/d,用前以蒸馏水稀释,加适量吐温80助溶),其它各组分别给以各提取物(以3.3g/kg/d生药剂量给药)。连续给药四周。3.1.3有机溶剂为红胆的大鼠肝肾毒性检测末次给药后,动物禁食不禁水24h,腹腔注射20%乌拉坦(10ml/kg),麻醉,迅速剖开胸腹,取心脏血约3ml,再用血管钳阻断胆囊管,取下胆囊,观察成石情况,并吸出全部胆汁。胆汁及血液在常温下放置40min,后3000r/pm离心10min,取胆汁上清液及血清,置于-20℃冰箱中保存待测。3.2实验研究的结果3.2.1建立模型的显著程度,即造模成功的标准胆囊内有泥沙样沉积物或松软团块物定为结石。记录成石个数,观察胆汁体积与粘度。两组间比较采用四格表确切概率(Fisherprobabilitesin2×2table)。检验,P<0.05为差异有显著性。如表2所示,模型组9只豚鼠中,8只形成结石,成石率为88.9%,与正常对照组相比,有显著差异(P<0.01),表明造模成功;WE有7只形成结石,占77.8%;EA组有4只形成结石,占40%;EE组有2只形成结石,占22.2%;以上三组与模型组相比,EE组、EA组有显著性差异(P<0.01),但与阳性对照组比较均无显著性差异。结果显示,EE、EA和爱活胆通对豚鼠实验性胆固醇结石具有显著的治疗作用。3.2.2胆固醇、血脂和总胆汁酸含量(TC)、总蛋白(TP)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、总胆汁酸(TBA);胆汁生化测定总胆固醇(TC)、总蛋白(TP)、磷酯(PL)、总胆汁酸(BA)、总胆红素(BTIL)的含量。见表3、表4。4连钱草醇提物提取物对人胆固醇结晶的治疗作用目前认为胆囊胆固醇结石的形成有多种原因,胆汁胆固醇超饱和,导致胆盐、卵磷脂、胆固醇比例失调,胆固醇易结晶折出,是致石的启动因素;糖蛋白的凝聚和促核作用及胆汁的瘀滞与胆石形成有重要关系。胆汁瘀滞,不能及时排空致石胆汁,在糖蛋白、细菌、寄生虫等成核因子作用下容易形成结石。本次实验通过给予豚鼠高胆固醇饮食,使豚鼠血清中TC、TG、LDL浓度增加,形成高脂血症。流行病学调查资料和研究证实,血脂质是影响胆汁脂质成分和比例的主要因素,脂质代谢异常是导致胆汁理化状态变化并向成石过渡的一个主要因素。所以,降低血脂水平能减少胆石症的形成。连钱草可有效地降低血清胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)以及胆汁中的胆固醇和粘蛋白浓度,提高胆汁中胆汁酸和卵磷脂含量,具有显著的治疗胆固醇结石作用。各项指标与单纯成石组比较均有显著性差异(P<0.01)。由此推测连钱草治疗胆固醇结石形成的机制可能是通过降低血清TC,TG和LDL-C浓度,升高血清HDL-C含量及胆汁中胆汁酸、卵磷脂含量,从而降低胆汁中胆固醇浓度,不致胆汁中胆固醇过饱和,阻止了“致石性胆汁”形成。本次实验测得各有效治疗组成石胆汁中的总蛋白和胆固醇含量明显低于模型组。蛋白质中的粘蛋白可作为胆石形成的成核因子,蛋白浓度过高,增加胆汁的粘度,使胆汁减慢,胆固醇易析出形成结石。实验观察各胆囊组织形态变化,发现模型组和水提液组有明显的炎症、水肿,部分样本胆汁较少且粘稠。可能炎症刺激了胆囊粘蛋白分泌,故胆汁中粘蛋白浓度高。推断连钱草促进胆汁分泌,降低了胆汁蛋白质的浓度。治疗组血清胆固醇降低,可能是连钱草提取物促进胆固醇转化成胆汁酸,或促进胆汁分泌,导致胆固醇浓度降低,同时胆汁酸又是胆固醇良好的助溶剂,胆汁酸含量的增加,加速了胆固醇的溶解度。连钱草含中丰富的植物甾醇,据报导,植物甾醇和甾烷醇对膳食中或内源性胆固醇具有明显的吸收阻碍作用。植物甾醇和甾烷醇可将小肠中的胆固醇沉淀下来,使其呈现不能溶解的状态,因此不能被吸收;还可将胆固醇-胆汁酸-磷脂形成的微胶囊中的胆固醇置换出来,使之不能经胆汁酸微胶囊运到小肠微绒毛的吸收部位,而胆固醇能溶解于小肠内腔胆汁微胶囊束是胆固醇吸收的必要条件;另外,植物甾醇在小肠微绒毛膜吸收胆固醇时与胆固醇竞争,阻碍对胆固醇的吸收。另外,连钱草挥发油中含有柠檬烯(Linmonene),据文献报导对胆固醇有很好的溶解作用。以上可能是连钱草能有效治疗动物实验性胆