DB6528T191-2023大蒜品种纯度SSR分子标记鉴定法

ICS67.080.01CCSB31

6528巴音郭楞蒙古自治州地方标准DB6528/T191—2023大蒜品种纯度SSR分子标记鉴定法PurityidentificationofgarlicvarietybySSRmolecularmarkers20232023080120230815巴音郭楞蒙古自治州市场监督管理局  发布DB6528/T191DB6528/T191—2023DB6528/T191DB6528/T191—2023目 次前言 II范围 1规范性引用文件 1术语和定义 1原理 1仪器设备和试剂 1仪器设备 2试剂 2方法步骤 2取样 2DNA提取 2分子标记筛选 2PCR扩展反应体系 3PCR扩展反应程序 3非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 4纯度计算 4附录A（规范性）溶液配制 5A.1溶液配制 5附录B（规范性）制胶及电泳过程 6B.1制胶及电泳过程 6参考文献 7I前 言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由新疆巴音郭楞蒙古自治州农业农村局提出、归口并组织实施。本文件起草单位：新疆巴音郭楞蒙古自治州农业科学研究院。本文件实施中的疑问，请咨询新疆巴音郭楞蒙古自治州农业科学研究院。（库尔勒市石化大道64号（新疆库尔勒市英下路巴州农科院新疆巴音郭楞蒙古自治州农业农村局联系电话邮编：841000新疆巴郭楞蒙古自治州农业科学研究院联系电话邮编：841000新疆巴音郭楞蒙古自治州市场监督管理局联系电话邮编：841000IIII大蒜品种纯度SSR分子标记鉴定法范围本文件规定了大蒜品种纯度SSRPCR本文件适用于焉耆盆地巴音郭楞蒙古自治州大蒜品种纯度鉴定。规范性引用文件（包括所有的修改单适用于本文件。GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法术语和定义3.13.13.2聚合酶链式反应polymerasechainreaction利用单链寡核苷酸引物对特异DNA片段进行体外快速扩增的一种方法。3.33.4 SSRsimplesequencerepeats（1个～6个为重复单位聚集而成的长达几十个至几百个一般为100bp～200bp）的串联重复序列，又称微卫星序列或短串联重复序列，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。3.53.6分子标记molecularmarker以蛋白质、核酸分子的多态性为基础，鉴定生物在遗传上的差异。3.73.8品种纯度varietypuritySSR4原理SSRPCR技术将多态的SSR6.05仪器设备和试剂1仪器设备PCR仪：垂直电泳槽；水平电泳槽；高压电泳仪（3000V，400mA，400W）；核酸浓度测定仪；万分之一电子天平；组织研磨仪；微量加样器；台式高速离心机；紫外可见成像系统；医用胶片观察灯；水平摇床；高压灭菌锅；微波炉；冰箱；数码相机。试剂EDT-Na2TrsHC3％NaC；（TEMED）；（37％）；TaqDNA（含Mg2+的10×PCR缓冲液NTPs）；SSR引物；琼脂糖；GoldView染料；DNA提取试剂盒；实验用水为双蒸水或符合GB/T6682规定的一级水。除特殊说明外，所用试剂均为分析纯试剂。相关溶液配制方法见附录A。方法步骤GB/T3543.230头、60瓣，样品质量应不少于500g。在玻璃培养皿底部垫上一层厚度3mm照培养箱中。培养条件为光照强度3000Lx条件下16h、35℃光照培养；无补光条件下8h、28℃暗培养。相对湿度70％。待鳞茎长出鳞叶后备用。称取鳞叶200mg左右用植物基因组DNA提取试剂盒内步骤提取DNA，所提取DNA浓度和纯度用核酸浓度检测仪测定，DNA完整性用DNA凝胶电泳检测。DNA溶液的OD260/OD280值应在1.7～2.0之间，或质量能符合检测要求。最终于—20℃冰箱中保存。注：以上为推荐的DNA提取方法。其他能够达到PCR扩增质量要求的DNA提取方法也适用于本文件。6.3分子标记筛选在玻璃培养皿底部垫上一层厚度3mm照培养箱中。培养条件为光照强度3000Lx条件下16h、35℃光照培养；无补光条件下8h、28℃暗培养。相对湿度70％。待鳞茎长出鳞叶后备用。称取鳞叶200mg左右用植物基因组DNA提取试剂盒内步骤提取DNA，所提取DNA浓度和纯度用核酸浓度检测仪测定，DNA完整性用DNA凝胶电泳检测。DNA溶液的OD260/OD280值应在1.7～2.0之间，或质量能符合检测要求。最终于—20℃冰箱中保存。注：以上为推荐的DNA提取方法。其他能够达到PCR扩增质量要求的DNA提取方法也适用于本文件。6.3分子标记筛选宜选择编号1号～81PCR10SSR8对引物仍未达到筛选效果的，可选择表1另外22对扩展辅助引物进行筛选。表1纯度鉴定引物2编号标记名称上游引物下游引物1GB-ASM-040CACAGCAACATGCACCATTGCCGGAACTCGATATT2GB-ASM-053ACAAGGTCGACATCGTTTGGGGCTTCACCTGAACACA3GB-ASM-072CACGCGAATCTTTCTTGGTGCAAAGCAATATGGCAG4GB-ASM-109GGTCTCCTCATCCACCGTGTGTGGGGCATGATTGAC5SSR7ATGCCGCCATTAAGCACTTGGCAAACAGGATTGGCACCAGPCRPCR总体积10μl，包括稀释浓度为30ng/μl的检测样品DNA1μl、纯度测定加入正反引物各0.5μl、2TaqPCRMix5l3μlddHO补充。PCR3表1纯度鉴定引物（续）编号标记名称上游引物下游引物6SSR8AGGATGGATGGACTTGCAAGGTGTGGTATCTGTGCCTGCTG7SSR11AACCATTTGATGCAGTGCGGCTGGCGGTAGAATGCGTTTG8ACM0318TCCTCCTTCCAAACCACATCGATCAGAAACAGCAGCGTC9AMS25GCAACCTTTCCCCGAGAGGAGGGCAGTGTTAGCATTCC10ACM326AAACCAGCAACAACCAATGAAAATTGGAGAGCAGGCAAA11ACM065GCTCTGATGGAGGATGGTTCCTTGCCATCTTTGTCGGT12ACM046TCCTCGTCACCACCACAGCTGAAAGGGAGTAGCGGAG13AMS26TTGTCCAAGTAGTTGTGAATCTAATCAAAGCATAGTTG14ACM187GTACTCGGGCAGTGGAGGTAGGAGCTGTCCAAATGCTAGG15ASESSR-14CCCCTTCGGTTGTTTTTCTTCTGGGTACGGTCGTTATTGG16ASESSR-30GCAGCAGTAGAAGAACCTGCTAACCTCTTTTGGTGCCTCCT17ASESSR-83CCAAAGCTCCCATCTTCATCCGTCGGCTCTCTTATTTTGC18ASESSR-91GTTCTCCGTTGCGTCAATCGAATTTGCATCTTTCCCCTTC19ACM086GCGGATTGGATCATCAGATTTTCTTGATTCCTCCGTTTGG20Asa06GGGGTGTTACATTCTCCCCTACCGCCTGATTTTGCATTAG21Asa07CTCGGAACCAACCAGCATACCCAAACAAGGTAGGTCAGC22Asa08TGATTGAAACGAATCCCACAGGGGGTTACCTGAACCTGTTA23Asa10TTGTTGTTCTGCCATTTTGATCTAAGCCGAGAGAAA24Asa59CGCTTACTATGGGTGTGTGTCCAAGTGGGAGACTGTTGGAG25SSR18GAGCTGAAGCAAAACCAACTTCGTCAGTGTATGGGAAAAGAGCC26SSR32ATTCCTAAGAGAGGACGAAGGCCTACTTCTGTGTGGATAAACGGC27SSR34AACTCTTTTCAAGCTCTGGACGTCACAGGTAATGTCAAGGATGG28SSR37CTTTAGCTGTTTGGTCGTTGTGACCTCGGCTCTTAAATCATACG29SSR68ATGTTGGATACTTCAGGCAGGTCGTTTTCTGCTCTCCTTCTCTC30SSR86AGAAGAGGCTAAAGGCCAAAGTTTTCCATCATCCCCATCATC943min；9430s，不同引物最佳退火温度退火45s，7290s；30次循环的最后一个循环延伸设定为10min，4℃保存扩增产物。6.6非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳按照附录B规定的方法，进行6％非变性聚丙烯酰胺凝胶制作及电泳检测扩增产物。纯度计算以筛选出来的SSR式中：C——品种纯度，单位为％。T——

C=T

×100％···················································(1)N——非本品种供检样品数，单位为个。44附录 A附录 B（规范性）附录 C溶液配制溶液配制引物稀释按照引物合成单说明先配制100μmol/L402.5μmol/L的使用液。10％过硫酸铵加过硫酸铵1g溶解并定量稀释至10mL，现配现用。5×TBE缓冲液Tri108g，硼酸55gEDT·2·N27.44g2000m。330%聚丙烯酰胺胶溶液加丙烯酰胺290g，甲叉双丙烯酰胺10g溶解并定量稀释至1000mL。6%聚丙烯酰胺胶5×TBE1013.525.5750μL混合溶液。现用现配。0.5×TBE用5×TBE缓冲液200mL稀释至2L。固定液用无水乙醇50mL，冰乙酸2.5mL，稀释至500mL。现配现用。渗透液加硝酸银1g溶解并定量稀释至400mL。现配现用。显色液加氢氧化钠5.5g溶解并定量稀释至400mL，使用时加入甲醛1.5mL。现配现用。5附录 D附录 E（规范性）附录 F制胶及电泳过程制胶及电泳过程凝胶制作将玻璃板洗净，用无水乙醇擦两遍，晾干。待玻璃板彻底干燥后，将其组装好。取5×TBE缓冲液10mL，30％聚丙烯酰胺胶溶液13.5mL，超纯水25.5mL，TEMED30μL，10％APS750μL，迅速混匀后灌胶。灌胶过程中防止气泡产生。灌胶结束后，将梳子齿向外，轻轻的插入胶中，使其聚合1h以上。电泳用洗耳球吹洗加样槽，清除气泡和杂质。每个加样孔加入3μL的检测样品PCR产物。100W恒功率电泳至上部的指示带（二甲苯青）到达胶板的中部。银染电泳结束后，小心分开两块玻璃板，凝胶紧贴在长板上。将长板置于固定液中轻轻晃动3min，双电泳结束后，小心分开两块玻璃板，凝胶紧贴在长板上。将长板置于固定液中轻轻晃动3min，双蒸水快速漂洗1次，不超过10s；渗透液中染色5min，双蒸水快速漂洗1次，不超过10s，显色液中轻轻晃动直至带纹清晰，双蒸水漂洗1min。6参考文献［1］BarbozaK，SalinasMC，AcuñaCV，etal．Assessmentofgeneticdiversityandpopulationstructureinagarlic(AlliumsativumL．)germplasmcollectionvaryinginbulbcontentofpyruvate，phenolics，andsolids［J］．ScientiaHorticulturae，2020，261：1089-1100.［2］BarbozaK，BerettaV，KozubPC，etal．Microsatelliteanalysisandmarkerdevelopmentingarlic：dis