毛细管等电聚焦电泳CIEF法标准操作规程SOP

毛细管等电聚焦电泳（CIEF法）原则操作规程类别工作原则文献文献编号XXXX版本号V01页码共15页执行日期XX月X日（严禁复印）审批页—起草人审核人审核人同意人部门分析研究部分析研究部分析研究部质量确保部姓名签名日期颁发部门：质量确保部分发部门：分析研究部拷贝号：NO./ 文献变更历史版本号执行日期变更因素、根据及变更内容V00XX月XX日新文献体系的新文献目录TOC\o"1-3"\h\u1 目的 42 范畴 43 定义 44 环境、健康和安全 45 培训 46 职责 47 程序（内容） 47.1 原理 47.2 实验材料 57.3 操作环节 67.4 成果分析 87.5 鉴定原则 97.6 注意事项 98 有关文献 99 参考文献 910 流程图 911 附录 9毛细管等电聚焦电泳（CIEF法）测定统计 1毛细管等电聚焦电泳（CIEF法）测定统计（合用于多个样品） 1目的规范毛细管等电聚焦电泳（CIEF法）检查的操作过程。范畴本规程合用于常规毛细管等电聚焦电泳检查，涉及到蛋白质等电点有关指标的测定。定义CIEF：毛细管等电聚焦电泳。pI：等电点。DDI：超纯水。环境、健康和安全乙酸其水溶液呈弱酸性且腐蚀性强，蒸汽对眼和鼻有刺激性作用，因此需适宜防护。氨水含有刺激性气味，易挥发，有毒，对眼、鼻、皮肤有刺激性和腐蚀性，能使人窒息。有燃烧爆炸危险。应储存于阴凉、干燥、通风处，远离火种、热源。培训培训部门：分析研究部。培训对象：分析研究部有关人员。培训方式和时数：授课，8小时。考核方式：现场操作。职责质量确保部：负责监督本文献的执行。分析研究部：负责严格执行本规程规定。程序（内容）原理两端电极槽中分别加入酸液和碱液，施加电压后毛细管中的操作电解质溶液逐步形成pH梯度，各溶质在毛细管中迁移至各自的等电点（pI）时变为中性形式聚焦的区带，而后变化检测器末端电极槽储液的pH值的办法使溶质通过检测器。采集色谱图后，根据各markerpI值与色谱峰的迁移时间的线性关系，从而得到供试品的pI值。实验材料试药与试液如无特殊阐明，全部试液使用期均为2~8℃，保存3个月。通用编号名称来源/配制1超纯水电阻率不低于18.2MΩ·cm，如无特殊阐明，本办法全部试液均用超纯水配制。2亚氨基二乙酸Sigma，货号203磷酸Sigma，货号3452454UreaSigma，货号U06315乙酸Sigma，货号3961mol/LNaOH溶液Sigma，货号7208273~10两性电解质GE公司，货号17-0456-018CIEFGelSciex，货号4774979阳极稳定液(0.20mol/L亚氨基二乙酸溶液)称取亚氨基二乙酸0.27g于15ml离心管中，加10ml水使之溶解，混匀备用。10阳极缓冲液

(0.20mol/L磷酸溶液)加水49.3ml于50ml离心管中，加磷酸685μl，混匀备用。11尿素溶液

(4.30mol/LUrea溶液)称取Urea10.8g，加水使之溶解，并稀释定容至50ml，混匀备用。12化学迁移液

(0.35mol/L乙酸溶液)加水49ml于50ml离心管中，然后加1ml乙酸，混匀备用。13阴极缓冲液(0.30mol/LNaOH溶液)加水35ml于50ml离心管中，然后加1mol/L氢氧化钠溶液15ml，混匀备用。正向办法（乙酸迁移法缓）编号名称配制1L-ArgSigma，货号A500623MUrea-CIEFGel(3.00mol/LUrea胶溶液)称取尿素1.8g，加CIEFGel使之溶解，并稀释定容至10ml，混匀后用5μm针头过滤器过滤备用。3阴极稳定液(0.50mol/LL-Arg溶液)称取L-Arg0.87g于15ml离心管中，加10ml水使之溶解，混匀备用。反向办法（氢氧化铵迁移法）编号名称配制15mol/L氢氧化铵溶液Sigma，货号31861226MUrea-CIEFGel(6.00mol/LUrea胶溶液)称取尿素3.6g，加CIEFGel使之溶解，并稀释定容至10ml，混匀后用5μm针头过滤器过滤备用。3化学迁移液(出口端，0.10mol/L氢氧化铵溶液)加水49ml于50ml离心管中，然后加1ml5mol/L氢氧化铵溶液，混匀备用。原则物质名称来源货号markerpI3.4北京博思雅生化技术研究院BSYK016-04markerpI4.1、5.5、7.0、9.5、10.0SCIEXA58481仪器与用品毛细管电泳仪：SCIEX公司PA800plus或CESI8000Plus。检测器：紫外检测器，波长280nm。毛细管卡盒：合用于7.2.2.1的毛细管电泳仪。毛细管：中性涂层毛细管（内径50μm），切割至总长为30.2cm，有效长度为20cm。孔塞：孔塞大小2（100μm×200μm）。超滤柱：Millipore，货号UFC5010BK。其它：样品瓶、蓝色橡胶瓶盖、内插管、移液器、离心机、离心管、超滤柱、量瓶、电子天平、涡旋混合仪。操作环节供试品超滤取供试品150~350μg加至超滤柱中，再加超纯水定容至500μl，以每分钟不低于13000转离心不少于15分钟。弃废液，加超纯水450μl于超滤柱中，以每分钟不低于13000转离心不少于15分钟。重复7.3.1.2最少1次。取出超滤柱，将其倒转装入一种干净的离心管中，以每分钟不低于3500转离心不少于3分钟收集样品。供试品配制样品缓冲液乙酸迁移法（3MUrea-CIEFGel200μl、3~10两性电解质12μl、阴极稳定液20μl、阳极稳定液2μl、pI原则品各2μl）*（N+1）；N为样品数量。旋涡混匀30S后备用。氢氧化铵迁移法（6MUrea-CIEFGel90μl、3~10两性电解质6μl、阳极稳定液15μl、pI原则品各2μl）*（N+1）；N为样品数量。旋涡混匀30S后备用。各项目所用marker以下：BF08pI3.4、pI4.1、pI5.5BF15pI4.1、pI7.0、pI9.5BF16pI3.4、pI4.1、pI5.5通用pI4.1、pI7.0、pI9.5取240μl上述样品缓冲液与10μl超滤后供试品混合并充足涡旋混匀30S。将样品移至内插管中，确认内插管下端无气泡后，将内插管放入样品瓶中并盖好蓝色橡胶瓶盖，放入样品托盘中。缓冲液瓶的准备在每个样品瓶中放入指定的试剂1.5ml，废液瓶中放入0.8ml超纯水，用蓝色橡胶瓶盖盖好。根据选用办法按照7.3.5将缓冲液瓶放入缓冲托盘中，再将托盘放入毛细管电泳仪。缓冲瓶的摆放乙酸迁移法缓冲液的摆放，如图7.1所示：图7.1乙酸迁移法缓冲液的摆放图示①为超纯水、②为阳极缓冲液、③为尿素溶液、④为CIEFGel、⑤为化学迁移液（0.35mol/L乙酸溶液）、⑥为废液、⑦为阴极缓冲液。氢氧化铵迁移法的摆放，如图7.2所示：图7.2氢氧化铵迁移法的摆放图示①为超纯水、②为阳极缓冲液、③为尿素溶液、④为CIEFGel、⑤为化学迁移液（入口缓冲液为0.35mol/L乙酸溶液，出口缓冲液为0.10mol/L氢氧化铵溶液）、⑥为废液、⑦为阴极缓冲液。编辑办法并调用毛细管的预解决：CIEFGel在50psi压力下冲洗5分钟，然后用超纯水在50psi压力下冲洗2分钟，最后用尿素溶液在50psi压力下冲洗5分钟。每次运行前应进行。供试品分离办法重要参数=1\*GB3①样品进样：在25psi压力下进样99秒。=2\*GB3②聚焦：25kV下运行5~45分钟。在乙酸迁移法中，聚焦勾选Normal模式；在氢氧化铵法中，聚焦勾选Reverse模式。=3\*GB3③迁移过程：30kV下运行15~45分钟。在乙酸迁移法中，迁移电压勾选Normal模式；在氢氧化铵法中，迁移电压勾选Reverse模式=4\*GB3④样品室温度：2~8℃。=5\*GB3⑤毛细管温度：18~22℃。=6\*GB3⑥检测器波长：280nm。供试品检测：将供试品位置号编辑入序列表中，输入对应供试品名称与文献名称，并调用有关办法。运行序列开始检测分析。成果分析在质量分析表中，输入marker的理论等电点及其迁移时间。以各marker相对应迁移时间为X轴，以各marker理论等电点值为Y轴，进行线性回归，通过回归方程计算目的蛋白质的等电点。按面积归一化法计算，以供试品主峰的校正峰面积（CPA）占全部峰CPA之和的比例计算主峰的所占比例，并分别统计酸性峰与碱性峰所占比例。鉴定原则见各品种项下规定。注意事项缓冲液瓶的数量取决于样品的个数，确保每8个循环都能使用新的缓冲液。在乙酸迁移法中，聚焦和迁移电压为Normal模式；在氢氧化铵法中，聚焦和迁移电压为Reverse模式。有关文献————参考文献BECKMANCOULTER.UserManuals[M].PA800plusPharmaceuticalAnalysisSystemCapillaryIsoelectricFocusing(cIEF)Analysis.B25804AA,January于传飞,郭玮,王兰,等.成像毛细管等点聚焦电泳法对单克隆抗体制品的电荷异质性分析[J].药品分析杂志,,34(7):1212-1215.流程图————附录 毛细管等电聚焦电泳（CIEF法）测定统计品名批号/编号规格开检日期年月日检查根据实验材料仪器设备名称生产厂家/型号设备编号毛细管电泳仪□SCIEX/PA800plus□SCIEX/CESI8000Plus离心机EppendorfCentrifuge5418R缓冲液缓冲液名称编号阳极缓冲液（0.20mol/L磷酸溶液）阴极缓冲液（0.30mol/L氢氧化钠溶液）尿素溶液（4.3mol/L尿素溶液）化学迁移液（0.35mol/L乙酸溶液）化学迁移液（0.10mol/L氢氧化铵溶液）阳极稳定液（0.20mol/L亚氨基二乙酸溶液）阴极稳定液（0.50mol/LL-精氨酸溶液）3MUrea-cIEFGel（3.00mol/L尿素胶溶液）6MUrea-cIEFGel（6.00mol/L尿素胶溶液）试药、试液耗材名称生产厂家货号批号/编号NeutralCapillarySCIEX477441CIEFMarkerKitSCIEXA58481其它：CIEFGelSCIEX4774973~10两性电解质GE17-0456-01超滤柱MilliporeUFC5010BK操作环节取供试品μg加至超滤柱中，再加超纯水定容至500μl，以每分钟转离心分钟。弃废液，加超纯水450μl于超滤柱中，以每分钟转离心分钟。重复操作环节2累计次。取出超滤柱，将其倒转装入一种干净的离心管中，以每分钟转离心分钟收集样品。根据下表配制样品缓冲液，将μl配制完毕的样品缓冲液与μl超滤后样品溶液混合，充足混匀后将其移至内插管中，将内插管放入样品瓶中并盖好蓝色橡胶瓶盖，放入样品托盘中。试剂名称取样量（μl）试剂名称取样量（μl）3~10两性电解质MarkerpI阴极稳定剂MarkerpI阳极稳定剂MarkerpI□3MUrea-CIEFGel□6MUrea-CIEFGel缓冲液瓶的准备按照下表位置，在每个样品瓶中放入指定的试剂1.5ml，废液瓶中放入0.8ml超纯水，用蓝色橡胶瓶盖盖好。InletBufferTray位置ABCDEF名称DDIDDI极缓冲液尿素溶液Gel化学迁移液-乙酸OutletBufferTray位置ABCDEF名称DDI废液极缓冲液化学迁移液□乙酸□氢氧化铵废液N/A在计算机中打开软件32Karat，建立新的序列程序，输入对应的供试品名称与位置，并选择对应的分离办法对供试品进行分析测定。数据积分点击“File”选择“Data”与“Method”，选择对应的数据与办法；点击“IntegrationEvents”添加积分参数；点击“Analyze”对数据积分；点击“Method”选择“QualitativeAnalysis”输入对应marker理论值与迁移时间；点击“Analyze”计算等电点；保存办法并打印报告。成果鉴定原则规定：□□N/A检查成果：检查结论：□符合规定□不符合规定□N/A备注附检测图谱页。操作人/日期：复核人/日期：下列无内容。毛细管等电聚焦电泳（CIEF法）测定统计（合用于多个样品）品名批号/编号规格开检日期年月日检查根据实验材料仪器设备名称生产厂家/型号设备编号毛细管电泳仪□SCIEX/PA800plus□SCIEX/CESI8000Plus离心机EppendorfCentrifuge5418R缓冲液缓冲液名称编号阳极缓冲液（0.20mol/L磷酸溶液）阴极缓冲液（0.30mol/L氢氧化钠溶液）尿素溶液（4.3mol/L尿素溶液）化学迁移液（0.35mol/L乙酸溶液）化学迁移液（0.10mol/L氢氧化铵溶液）阳极稳定液（0.20mol/L亚氨基二乙酸溶液）阴极稳定液（0.50mol/LL-精氨酸溶液）3MUrea-cIEFGel（3.00mol/L尿素胶溶液）6MUrea-cIEFGel（6.00mol/L尿素胶溶液）试药、试液耗材名称生产厂家货号批号NeutralCapillarySCIEX477441CIEFMarkerKitSCIEXA58481其它：CIEFGelSCIEX4774973~10两性电解质GE17-0456-01超滤柱MilliporeUFC5010BK操作环节样品超滤样品批号/编号供试品体积(μl)蛋白量(μg)加水定容至500μl,14000rpm,15min弃废液,加水450μl,14000rpm,15min4500rpm,3min收集样品次次定容至μl次次定容至μl次次定容至μl次次定容至μl次次定容至μl次次定容至μl样品缓冲液试剂名称取样量（μl）试剂名称取样量（μl）3~10两性电解质MarkerpI阴极稳定剂MarkerpI阳极稳定剂MarkerpI□3MUrea-CIEFGel□6MUrea-CIEFGel样品准备样品批号/编号超滤后样品体积(μl)样品缓冲液体积(μl)充足混匀后将移至内插管中，将内插管放入样品瓶中并盖好蓝色橡胶瓶盖，放入样品托盘中