植物纤维素合成酶基因家族的进化分析

植物纤维素合成酶基因家族的进化分析

植物中的这种遗传因素被认为是植物纤维素酶的激化亚基。OsCesA基因所编码的蛋白可组装成一种复杂的纤维素合成酶复合物,并参与细胞壁生物合成以及次生细胞壁合成。目前已从40多种植物中克隆了1400多个相关的序列并发布在公共数据库里,但对其功能和进化关系的研究目前尚少。为此,笔者利用3种模式植物(拟南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)和毛果杨(Populustrichocarpa))的基因组序列研究纤维素合成酶超基因家族的亲缘关系,同时还分析了水稻纤维素合成酶启动子的超基因家族,以确定其可能的表达和调控模式。1材料和方法1.1构建蛋白库CesA基因序列;毛果杨的全基因组序列和信息还参考了NCBI,并导入DNAtool构建蛋白库。此外,利用Blastp和Blastn对DNAtool中毛果杨全基因组的数据库进行序列搜索,检索条件为E=0,Score>1200,将所得到蛋白序列作为候选序列,然后利用MEGA4.0对候选基因序列进行校正。1.2蛋白质序列的分析采用ClustalX1.83软件进行CesA,利用MEGA4.0程序对CesA基因编码的蛋白质序列按照邻接法、最小进化法分别构建系统发生树。这两个进化树显示的拓扑结构类似,由于邻接法具有较高的bootstrapping支持率,因此笔者主要利用邻接法构建的系统发生树加以分析。1.3遗传多样性的检测核苷酸多态性(nucleotidediversity)是衡量一个给定群体的遗传多态性的指标,用π表示。在此研究中,π被用来检测CesA基因在不同物种中的多样性与相似性,π值越小,群体的多样性程度越低。ka表示非同义突变率,ks表示同义突变率。通过对3个物种ka和ks的计算,研究它们潜在的进化关系。1.4dna的提取和pcr扩增水稻种子先在(28±1)℃的黑暗环境中用蒸馏水浸种2d,然后转移至放置两层滤纸并加有适量蒸馏水(以刚刚浸没种子为宜)的培养皿中。每个培养皿放50粒种子,置于黑暗培养室中萌发3d,培养温度(28±1)℃。待种子萌发后,转移至放置石英砂的盒子中,使用1/5的Hogland培养液继续培养幼苗长至3叶1心期,用含10μmol/LABA的Hoagland培养液对水稻苗处理0、6、12、24、48和120h后,收集材料用液氮速冻后保存于-80℃冰箱备用。总RNA的提取采用常规的TRIZOL(Invitrogen,USA)方法,反转录采用M-MLV反转录酶。cDNA第1链合成以后,进行半定量PCR反应,检测CesA基因家族各成员的表达水平。PCR扩增体系如下:总体积50μL,cDNA2μL,10×PCRBuffer5μL,25mmol/LMgCl23μL,10mmol/LdNTPs1μL,10μmol/L正义引物和反义引物(表1)各1μL,2.5μmol/(min·μL)TaqDNA聚合酶0.5μL,其余用水补足至50μL。PCR反应程序如下:94℃3min,95℃30s,60℃40s,72℃60s,30个循环,1.2%琼脂糖凝胶电泳。2结果与分析2.13毛果杨生产基因的扩增从拟南芥基因组注释数据库中获得10个AtCesA基因,其中5个集中分布于第5号染色体上,但并不连续,3个分布于第4号染色体,剩下2个分布于第2号染色体上。绝大部分AtCesA基因的蛋白质长度在1000～1100个氨基酸之间,只有AtCesA8含有985个氨基酸,AtCesA基因所含有的外显子的数目差别不大,其中AtCesA1、AtCesA3、AtCesA10含有14个外显子,AtCesA2、AtCesA5、AtCesA6、AtCesA9含有13个外显子,AtCesA4、AtCesA7、AtCesA8含有12个外显子。从水稻基因组注释数据库中获得了水稻的11个OsCesA基因。3个OsCesA基因分布于水稻第7号染色体上,其他的OsCesA基因各分布在不同的染色体上。除OsCesA10、OsCesA11外,其他基因在NCBI中都有注册,这些拥有基因注册号的OsCesA蛋白长度为1000个氨基酸左右,除OsCesA7、OsCesA9外其他基因的外显子数目为13或者14个。OsCesA10、OsCesA11两个基因还未测得全长序列,也无基因注册号,其蛋白质的氨基酸数目和基因的外显子数目都远远小于其他的OsCesA基因。从毛果杨基因组注释数据库(/Poptr1_1/Poptr1_1.home.htm)中下载全基因组序列和蛋白序列,将毛果杨的全部蛋白序列导入DNAtool软件程序中,建立蛋白库。另外再从Genbank里找到已知毛果杨的4个PtrCesA基因,分别为PtrCesA1、PtrCesA2、PtrCesA3、PtrCesA4,以其中任意一个基因的CDS序列通过Blastp和Blastn与DNAtool里的蛋白库进行相似性比对,得到了18个高度同源的毛果杨基因序列,用上述4个基因中任一个作为模板,得出比对结果均一致。对这18个基因做进一步比对,发现基因序号为818594和207792的两个基因序列完全相同,是同一个基因的两个不同序列号。因此,此次检索出17个基因可作为进一步研究的CesA基因。2.23个不断细化的形态分子中细胞家族规模的扩张利用3个物种CesA基因的CDS区序列,用邻接法构建的系统发生树进行分析,结果见图1。如图1所示,进化树将这些纤维素合成酶基因分成6个亚家族,每组都包含3个物种的基因,表明CesA基因在拟南芥、水稻和毛果杨3个物种分化前就已经分化。在基因进化过程中,突变积累的数量和时间成正比,所以拟南芥和毛果杨的遗传距离相对较近,而与水稻的遗传距离相对较远。对3个物种CesA基因序列做进化树分析,发现了14对旁系同源基因(3对属于拟南芥、3对属于水稻、8对属于毛果杨),其中毛果杨的旁系同源基因占毛果杨基因总数的94%,表明该亚族在单子叶和双子叶植物分离之后按照物种特异性的方式进行了扩张。分析认为,在这3个物种的祖先物种中可能只存在少量的CesA基因,但在物种分离之后,通过基因重复的方式,使基因家族规模得到扩张,形成了现在的规模。但是笔者还发现几个同源基因簇的扩张程度并不一致,尤其是各物种的扩张程度不一致,比如拟南芥和毛果杨在第2组中的基因均扩张了,可是水稻在该组中仅具有1个基因,表明水稻中该亚族没有扩张。2.33个物种的核苷酸差异度拟南芥、水稻和毛果杨中共有38个CesA基因,通过基因间核酸和蛋白序列比对,研究了这些基因的核苷酸差异度(π)和相似度(h),结果如表2所示。3个物种的核苷酸差异度大小分布比较广泛,其中蛋白水平序列平均差异度为0.395,基因序列的平均差异度为0.472。在各个物种内,拟南芥、水稻和毛果杨的碱基序列平均差异度分别为0.449、0.509和0.407。拟南芥和毛果杨均属于双子叶植物,其相似程度较高,水稻属于单子叶植物,与前两者的相似程度较远。2.43核苷酸多态性3个物种的CesA基因核苷酸多态性如图2所示,拟南芥和毛果杨的CesA基因核苷酸多态性在400～800bp和2000～2200bp之间,在这个区域处核苷酸多态性π值在3个物种中都很高,表明这是突变的热点区,是基因的高变区。就整个基因的核苷酸多态性来看,1000～2000bp之间π值较低而且相对稳定,是基因的保守区域,在其他区域还有一些较小的峰值,说明整个基因区域还存在其他一些热点突变位点。2.53基于知识的重复判断分子进化的中性学说认为,分子水平上的大多数突变是中性或近中性的,自然选择对它们不起作用,这些突变全靠一代又一代的随机漂变而被保存或趋于消失,从而形成分子水平上的进化性变化或种内变异。一般情况下,当DNA序列的Ka/Ks>1时(Ka值代表非同义置换,Ks值代表同义置换),则表示正选择作用存在,Ka/Ks<1时,表示负选择作用或净化作用,中性条件下,Ka/Ks的期望值为1。为了能够准确推断基因重复的信息,用于分析的所有CesA类型基因都是其全长CDS序列。对于进化树上的每个节点,其Ks的平均值即为左右两侧所有序列之间配对Ks的算术平均值,它代表此处序列基因重复发生的时间。分析表明,拟南芥、水稻及毛果杨中CesA的Ka/Ks分别为0.3、0.35和0.28,代表CesA基因是趋向负选择压力,即受到纯化作用影响。2.6aba对水稻系统发育过程中ced表达的影响OsCesA基因做启动子调控元件分类,这些上游顺式调控元件主要分为激素类响应调控元件、环境因素类响应调控元件、与细胞内化学反应相关的调控元件和其他一些类型(表3)。典型的激素类响应调控元件有ABRE响应元件,同时也含有与乙烯、细胞分裂素、生长素、水杨酸和茉莉酸等相关的调控元件,顺式调控元件响应的环境因子有光照、干旱、盐胁迫、温度、氧气等,水稻体内响应的代谢反应主要有脱水反应、黄化反应及氧化磷酸化等。除此之外,还含有一些与光敏色素、昼夜节律相关的启动子调控元件。水稻11个CesA基因的启动子中存在ABRE、MYC、MYB序列。笔者推测水稻CesA基因的表达可能受两种途径的ABA信号的调控,ABA依赖性途径和非ABA依赖性途径。如CesA基因的启动子中ABRE-complex的形成需要ABRE附近的MYC或者MYB序列的参与。DRE1核心序列的存在说明CesA基因的表达也可能受到非ABA依赖性途径的调控,并且可能存在ABA依赖型和非ABA依赖型途径的交叉网络。所以选取与逆境胁迫密切相关的响应因素ABA进行表达分析。用10μmol/LABA处理三叶一心期的水稻幼苗,以未加入ABA的同等处理的水稻幼苗做对照,研究植物激素ABA对水稻OsCesA基因家族各个基因表达差异,结果见图3。根部的OsCesA1、OsCesA3和OsCesA7在ABA处理后表达发生了变化,其中对照中OsCesA1和OsCesA3的表达逐渐上升,而在ABA处理后,其表达在短时间内受到应激上调表达,随后表达量急剧下降;OsCesA7则恰恰相反,原来在对照中表达量较大,而ABA处理后表达量出现了明显的下降,由此推测在ABA处理6h内,OsCesA1和OsCesA3在激素的诱导下产生应激反应导致基因表达上调,随着应激反应的消失基因受到ABA的抑制,表达下调。在茎部,OsCesA5和OsCesA9在正常情况下表达量较高,但是用ABA处理1d后表达量显著下降,到第5天后,基因表达量开始有所恢复,推测该基因在茎部有可能还受到其他代谢途径的调控,从而产生基因表达量恢复的现象;OsCesA7的表达量在ABA影响下有轻微下调,但是与根部相比,表达量下调幅度较小。在叶部,OsCesA1在ABA处理下表达几乎完全被抑制;OsCesA9的表达量在初期也出现了明显的下降,但是2d后,表达量又恢复了。综合以上分析表明,在根部、茎部、叶部,不同OsCesA基因家族的表达受到了差异性的影响,各个基因表达调控的时间也不尽相同。3干旱胁迫对等性型别cea基因表达的影响纤维素的合成是由纤维素合成酶CesA基因在转录水平上进行调控的,CesA通过参与纤维素的合成在植物细胞壁合成过程中发挥了重要的作用。毛果杨中系统进化分析显示与次生细胞壁合成有关的CesA基因来自同一个远古基因,且纤维素合成酶的活性在植物生长中具有重要作用。拟南芥中已克隆了10个CesA基因,通过比较表明,拟南芥的10个CesA基因最大的差异在于某些区域中内含子的有无,内含子的位置是确定纤维素合成酶功能的关键因素之一。人们利用对突变体的研究已经探索出了拟南芥中6个CesA基因的特征,通过cDNA、EST和基因组序列比对,查找到了众多其他物种的CesA基因,包括从水稻中查找出了11个CesA基因以及毛果杨中的17个CesA基因。笔者对37个CesA基因进行序列比对后显示,这些序列高度同源,构建成的系统发生树中,双子叶的拟南芥和毛果杨的遗传距离相对较近,而它们与单子叶水稻的遗传距离比较远。CesA基因在分化后的各个物种中又进行了基因扩张,增加的CesA基因数目和种类,为植物更好地调控自身纤维素结构合成作出了重要的铺垫。另外各个物种中蛋白水平的核苷酸差异度小于整个基因水平的差异度,表明CesA基因的编码区部分更为保守,而且通过对其Ka/Ks的分析,推测其整个家族是趋向于负选择压力的。中国是水资源季度分布不均匀的国家,研究水稻OsCesA在干旱环境中的表达情况,对植物CesA的充分高效利用有重要意义。而植物对渗透和干旱等水分胁迫存在两类逆境响应的信号通路,即脱落酸依赖