组蛋白去乙酰化酶6在脑卒中后抑郁小鼠脑海马中表达变化的研究

PAGEPAGE15编号：课题名称：组蛋白去乙酰化酶6在脑卒中后抑郁小鼠脑海马中表达变化的研究课题负责人：所在班级：中西医结合学院临床医学乙班起止年限：申请日期：共青团福建中医药大学委员会制一、主要研究内容（研究目的、意义、技术经济价值）：研究目的：脑卒中后常出现抑郁症，目前已发现组蛋白去乙酰化酶6（HDAC6）与抑郁症相关。本实验拟通过比较脑卒中后抑郁小鼠、脑卒中后无抑郁小鼠与正常小鼠脑海马区中HDAC6的表达变化，由此探讨HDAC6在脑卒中后抑郁中的作用,为临床防治脑卒中后抑郁症提供可靠的实验理论依据。研究意义：脑卒中后可引发抑郁症。目前大量的临床和基础研究集中于继发或伴发抑郁症的病理生理机制和防治方面的研究。近年国内外研究显示，抑郁症亦可增加脑卒中的患病风险，并使之预后变差。脑卒中后抑郁(post-strokedepression，PSD)是卒中后以持续心情低落为主要特征的心境障碍，总体发生率高达25％～79％，可伴有兴趣缺乏、悲观失望，甚至自杀行为。它不仅影响患者的生活质量、延缓患者的神经功能和认知功能的恢复，而且增加病死率，给患者及其家庭乃至社会带来了十分沉重的负担。HDAC6作为催化组蛋白去乙酰化作用的关键酶类，已被发现与抑郁有关，弄清脑卒中后抑郁症中HDAC6表达变化将给防治脑卒中后抑郁症带来可靠依据。通过本实验有助于提高人们对脑卒中后抑郁症的认识，并找出解决因共病使得疾病迁延不愈而增加疾病负担与治疗难度这一问题的方法，有助于临床上的诊断鉴别与防治，研究组蛋白去乙酰化酶6在脑卒中后抑郁中的机制具有广阔的前景。技术经济价值：研究表明脑卒中后伴发抑郁症，然而迄今国内外还未见相关的临床和基础研究报道其与组蛋白去乙酰化酶6有关。但脑卒中后抑郁的研究日益引起关注与重视。我们观察HDAC6在脑卒中后抑郁小鼠脑海马区中的表达变化，进一步探讨脑卒中后抑郁症的发生机制。通过系统的研究，随着这些问题的解决及其作用机制的阐明，提高人们对脑卒中伴发抑郁的认识和处理，给临床上对脑卒中后抑郁的诊治带来新的突破。二、国内外现状、水平及发展趋势：1.组蛋白去乙酰化酶6（HDAC6）与抑郁在大脑发育中，一种名为组蛋白去乙酰化酶6(HDAC6)的蛋白质会增多，而在产生血清素的神经细胞中，也含有很多这种蛋白质。研究中发现，如果阻碍蛋白质发挥作用,能获得与使用抗抑郁药物相同的效果[1]。2.脑卒中后抑郁研究现状缺血性脑卒中作为临床常见疾病，往往造成神经功能受损，给患者带来极大心理负担。PSD是脑卒中最常见的并发症之一，以情绪低落、兴趣减退为主要表现，发病率占所有脑卒中患者的25％～79％[2]临床上对PDS的重视程度不够，脑卒中后抑郁经常被人们忽略。既往研究结果证实[3]，抑郁情绪明显影响脑卒中患者神经功能的恢复，在伴有卒中后抑郁的脑血管病患者，康复期的神经功能缺损恢复较慢，而且其最重的神经功能及生活能力恢复也较差。3.关于脑卒中后抑郁小鼠模型的建立[4]PSD是脑卒中后以情绪低落为主要表现的一类精神障碍疾患，在脑卒中后最初2年尤为高发[5]，轻者产悲观失望情绪，对疾病恢复缺乏信心，不能积极配合治疗；重者还会出现绝望和濒死感以及自杀行为，不仅加重患者认知损害、降低生活质量，还会使病死率和致残率大幅升高。与普通抑郁障碍不同，PSD患者都经历了或轻或重的脑血管意外，后者导致的脑神经损害势必会对其后的抑郁发生带来一定影响，使得PSD具有可能不同于普通抑郁障碍的病理生理机制。尽管PSD发病机制尚不完全明了，但目前有两种主要观点：一种认为PSD由社会心理应激所致，另一种认为脑血管病变影响了参与情绪调节的中枢神经环路，继而导致PSD的发生。既往脑卒中史、脑卒中前不良生活件、家庭或个人情绪障碍史、独居、缺乏社会支持等可能都是PSD的高危因素。患者神经功能受损越严重，所受的心理打击就越大，越难调节自身心理状态，也就越易产生抑郁情绪[6]。在人类疾病研究历程中，动物模型成为了必不可少的工具，而理想模型要求能较好地模拟相应疾病的致病机制和核心临床特征。现已有多种脑缺血模型制备方法，如线栓法[7]、肾性高血压大鼠自发脑梗死法[8]、四血管阻断法等，而建立抑郁模型的主要策略是给动物以应激刺激，使其产生行为绝望或无助情绪，如束缚应激、慢性不可预见性轻度应激模型[9]和孤养／分养模型等。研究表明，束缚应激可通过严格限制动物的活动而诱发类似人类抑郁障碍的核心症状，该方法已得到国内外学者的广泛认可。本实验中我们采用线栓法，通过线栓阻断小鼠左侧大脑中动脉，复制出局灶性脑缺血再灌注模型，其脑血管病理特征与临床脑卒中基本相似。同时从术后1W开始施以束缚处理，因为脑缺血小鼠的运动功能受损症状(悬挂试验、运动平衡及协调试验)在术后1W时已基本恢复[10]，此时开始束缚可使动物行为继续受到限制，从而较好地模拟了脑卒中患者早期肢体无力、行动不便而被动卧床的实际情况。2W束缚后，脑缺血+束缚组小鼠的蔗糖水偏好比显著降低(快感缺乏)，强迫游泳“不动时间”延长(失望情绪)，旷场中的运动活动(水平运动得分)明显减少，对新鲜环境的好奇程度(垂直运动得分)降低，连同在实验期间观察到的体重下降、进食量减少、清洁动作缺乏等表现，都较好地复制了内源性抑郁障碍的核心症状。该动物模型的制备方法简便易行，实验重复性好，动物病死率低，可作为理想的PSD小鼠模型。该模型拥有与临床脑卒中相似的脑血管病理基础及抑郁障碍的核心临床征象，为深入研究PSD的病理生理机制提供了可靠的动物实验平台。4.脑卒中后抑郁与海马脑卒中后抑郁在神经影像学可表现为海马体积的缩小以及脑杏仁核缩小及结构异常。本次实验拟通过对脑卒中后抑郁小鼠海马区切片中HDAC6的观察，探究HDAC6的主要作用机制。参考文献[1]KenjiHashimoto,ChibaUniversityCenterforForensicMentalHealth,Japan.LossofdeacetylationactivityofHdac6affectsemotionalbehaviorinmice[J].PLOSONE,2012[2]SpallettaG，RipaA，CaltagironeC．SymptomprofileofDSM-IVmajorandminordepressivedisordersinfirst—everstrokepatients[J]．AmJGeriatrPsychiatry，2005，13(2)：108-l15．[3]何锦照．急性脑卒中后抑郁状态对神经功能康复的影响[J]．中国医药导报，2010，7(29)：28．[4]许波，张良成等。脑卒中后抑郁小鼠模型的建立[J].西南国防医药2010,20(7):727-729.[5]AbenI，VerheyF，HonigA，eta1．Researchintothespecificityofdepressionafterstroke：areviewonallunresolvedissue[J]．ProgNeuropsychopharmacolBiolPsychiatry，2001，25(4)：671-689．[6]WhyteEM，MulsantBH．Poststrokedepression：epidemiologypathophysiology，andbiologicaltreatment[J]．BiolPsychiatry，2002，52(3)：253-264．[7]LongaEZ，WeinsteinPR，Carlsons，eta1．Reversiblemiddlecerebralarteryocclusionwithoutcraniotomyinrats[J]．Stroke，1989，20(1)：84-91．[8]洪华，黄如训，王庭槐，等．脑卒中后抑郁大鼠模型的建立[J]．中国临床康复，2002，6(9)：1266-1267．[9]WillnerP，TowellA，SampsonD，eta1．Reductionofsucrosepreferencebychronicmildunpredictablestress,anditsrestorationbyatricyclicantidepressant[J]．Psychopharmacology(Berl)，1987，93(3)：358-364．[10]郭俊，刘立．束缚应激对局灶性脑缺血小鼠行为的影响[J]．解放军医学杂志，2006，31(1)：45-47．三、研究的阶段性目标、最终目标及采用的实验方法：阶段性目标：第一阶段：构建脑卒中后抑郁小鼠模型及脑卒中后不抑郁小鼠模型第二阶段：对模型组小鼠进行抑郁检测，筛选符合标准的抑郁小鼠第三阶段：分别获取组一和组二各小组小鼠的全脑,为下一步做准备第四阶段：Westernblot检测组一小鼠脑海马区中HDAC6表达和免疫组织化学法检测组二小鼠脑海马区切片中HDAC6的表达变化第五阶段：整理分析实验资料，实验数据用统计学软件分析，并完成论文的撰写最终目标：研究出组蛋白去乙酰化酶6在脑卒中后抑郁小鼠脑海马区中的表达变化，为临床上对脑卒中后抑郁治疗方法寻找新的突破点，为进一步研究提供可靠依据。实验方法：1.实验物品的准备：5月龄小鼠60只，一个星期适应性培养后，随机分为六组，每组10只，分别为eq\o\ac(○,1)正常组一，eq\o\ac(○,2)脑卒中后抑郁组一，eq\o\ac(○,3)脑卒中后不抑郁组一；eq\o\ac(○,4)正常组二，eq\o\ac(○,5)脑卒中后抑郁组二，eq\o\ac(○,6)脑卒中后不抑郁组二。实验期间动物单笼饲养并自由进食水。2．脑卒中后抑郁小鼠模型及脑卒中后不抑郁小鼠模型的构建局灶性脑缺血模型的制作将实验组eq\o\ac(○,2)eq\o\ac(○,3)eq\o\ac(○,5)eq\o\ac(○,6)参照线栓法制备小鼠脑缺血再灌注模型，术中用1%戊巴比妥钠（10ml/kg）进行腹腔麻醉。阻断左侧大脑中动脉血流60min后拔出线栓，实现血液再灌注。术后24h参照Komine—Kobayashi等标准对动物行神经功能评分，将1～3级小鼠视为造模成功，纳人后续实验。2.2束缚处理从术后1W开始，将eq\o\ac(○,2)eq\o\ac(○,5)组小鼠置于长约7.0cm、直径约3.0cm，且通风良好的圆柱体塑料管内2h，1次／d，持续2W。随机选择每日束缚时间，以避免单一时间刺激使动物快速产生适应。束缚处理后获得脑卒中后抑郁小鼠模型2.3对所有组小鼠抑郁行为检测2.3.1蔗糖水消耗试验从束缚结束前1d开始动物禁食水24h，然后在每笼放置2个水瓶，分别装自来水和2％蔗糖水溶液。观察小鼠24h内自来水和蔗糖水溶液饮用量，计算蔗糖水偏好比=蔗糖水消耗量／总液体消耗量×100％。为避免动物对位置的偏好干扰试验结果，其间不时调换两水瓶位置。2.3.2旷场试验在束缚结束后第1d进行。旷场为一50cm×50cm×50cm正方体，底面含25个等边方格。将动物置于中心方格内，观察2.3.3强迫游泳试验于束缚结束后第1d8：00am一10：00am，取一35cm×30cm×20cm长方体容器，内装10cm深的温水(25℃)，将每只动物放入水中5min，记录其在水中保持“不动状态3.Westernblot检测小鼠脑中HDAC6的含量3.1将正常组一，脑卒中后抑郁组一，脑卒中后不抑郁组一小鼠用断颈法处死，迅速取小鼠全脑,分割海马区，匀浆。3.2总蛋白的提取：用胰酶-EDTA将细胞消化，用PBS溶液洗3次，弃去PBS溶液后，加入适量体积的蛋白提取液（1m预冷的LysisBuffer加入5ul磷酸酶抑制剂1ul蛋白酶抑制剂和5ul100MmPMSF，三种试剂均放在制冷盒中）后，旋涡振荡器混匀，冰浴振荡15min（将摇床放在冰箱中）。于4℃，12000r/min离心20min，收集上清液，分装于Ep管中（一般每管100ul），-80℃保存（保存时间短3.3凝胶电泳：取总蛋白50μg，加入5×SDS上样缓冲液，混合后100煮沸5min使蛋白充分变性，冷却后10000r/min离心30s。按照顺序依次在12%SDS凝胶梳子孔道加样，防止样品之间的交叉污染，恒压80V进行电泳，当蛋白条带迁至底部时即关闭电源。3.4转膜：根据预染Marker条带将胶条割至合适大小，滤纸、PVDF膜也切成同等大小，滤纸和凝胶用转膜缓冲液平衡，PVDF膜用无水甲醇活化1min，转膜装置从下至上依次按阳极碳板、1层滤纸、PVDF膜、凝胶、1层滤纸、负极碳板的顺序放好，按1mA/cm2接通电源，转移1h。3.5免疫反应：取出PVDF膜，用TBS从下向上浸湿后，用5%脱脂奶粉进行封闭1h，然后用一抗4℃孵育过夜；用TBST液洗膜30min(洗涤次数3次,每次10min)，用HRP标记的二抗（1∶5000）室温下孵育2h。杂交后用TBST液洗膜30min(洗涤次数3次,每次10min3.6化学发光、显影：将杂交膜置于等体积超敏ECL化学发光试剂AB混合液1min，然后用保鲜膜成像包好置于化学发光仪曝光，将条带用凝胶成像系统分析，计算出灰度值。3.7.统计学分析：化学发光成像仪将灰度值结果，存储与电脑中并自动计算参数。结果采用SPSS17.0统计软件进行统计。各组间比较采用单因素方差分析，实验数据采用均数±标准差（X±SD）表示，P＜0.05有统计学意义。4.免疫组织化学法检测4.1将正常组二，脑卒中后抑郁组二，脑卒中后不抑郁组二小鼠用断颈法处死，迅速取小鼠全脑，制作石蜡切片，石蜡切片置60℃4.2二甲苯中脱蜡梯度酒精入水(无水乙醇95%酒精)，浸泡于蒸馏水中待用。4.3.抗原修复取500mlEDTA抗原修复工作液于1000ml烧杯中，在小功率电炉上，热至似沸微沸为了防止脱片。将组织切片缓慢放入烧杯，继续加热，保持液体在微沸状态20分钟。将烧杯移开火源，室温下自然冷却后取出切片，蒸馏水洗1次3分钟，TBS洗2次每次3分钟。4.4.每张切片加一滴或50ul3%过氧化氢溶液,室温下孵育10min,以阻断内源性过氧化物酶的活性。TBS冲洗3次,每次3min。4.5.除去TBS液加一滴或50ul一抗（1:3000稀释），阴性对照采用普通血清，室温下孵育2小时或4℃4.6.TBS洗3次，每次5min，除去TBS液，每张切片加一滴或50ulpolymerenhancer（试剂A），室温下孵育20min，TBS冲洗3次，每次3min。4.7.除去TBS液，每张切片加一滴或50ul过氧化物酶标记的抗HDAC6聚合物(试剂B),室温下孵育30min，TBS洗3次，每次3min。4.8.除去TBS液，每张切片加一滴或50ul新鲜配制的DAB,显色3-10min。4.9.自来水冲洗,苏木素复染10min,水冲洗。0.1%的盐酸分化,自来水冲洗,TBS返蓝。4.10.不需脱水直接用中性树脂封片5.观察记录数据，统计学分析四、研究进度2012年12月-2013年01月文献检索，实验设计，