医学分子生物学：第十八章 基因的复制修复与重组

1

第十八章基因的复制、修复与重组

2

分子生物学的中心法则（central

dogｍa）

1958年Crick提出的遗传信息从DNA经RNA流向蛋白质的过程

1970年Temin提出“逆转录”

34

第一节

DNA复制的基本特点

一、半保留复制(Semi-conservative)

DNA生物合成时，亲代的DNA双链，每股链都可以作为模板，按碱基互补配对原则指导DNA新链的合成，这样合成的两个子代DNA分子，碱基序列与亲代分子完全一样。但一条链是来自亲代的DNA链，另一条链是新合成的链，此即为半保留复制（semi—conservativereplication）

1958年M.MesselsonandF.W.Stahl同位素实验证实

56二、复制的起始和双向进行

复制起始点(origin，ori)

大肠杆菌一个,真核细胞多个

双向复制(bi-directionalreplication)

“θ型复制”

不同生物的复制速率不相同

大肠杆菌40min

人8h

78

复制泡(replicationbubble)或复制眼(replicationeye)

复制叉(replicationfork)

复制子(replicon):

复制起始点和两侧的复制叉共同构成的一个单位

910

三、半不连续复制

DNA聚合酶(DNApolymerase)5′→3′合成

前导链(1eadingstrand)

随从链(1aggingstrand)

冈崎片段(okazakifragment)

大肠杆菌1000－2000base

动物100－200base

1112

四、RNA引物

DNA聚合酶不能催化两个游离的dNTP聚合

RNA聚合酶抑制剂（-）DNA复制

冈崎片段5‘

端含有4-12核苷酸的RNA引物

RNA引物提高DNA复制的真实性

1314

DNA复制的RNA引物

复制DNARNA引物

噬菌体T4PPPAC(N)3

噬菌体T7PPPACCA

PPPACCC

酵母PPPA(N)8~12

果蝇PPPA(N)7~9

淋巴母细胞PPPA(N)8

PPPG(N)8

N：任何核苷酸

1516

第二节参加DNA复制的酶类

和某些蛋白质

一、大肠杆菌的DNA聚合酶

5‘3’聚合

3‘，5’

磷酸二酯键

17

(一)

DNA聚合酶Ⅰ(Kornberg酶)

1958年Kornberg

/68KD大片段（Klenow酶）

103KD多肽

\36KD小片段

聚合

3‘5’外切酶活性校读功能（proofreading）

5‘3’外切酶活性切除5‘RNA引物和DNA修复

181920

（二）DNA聚合酶Ⅱ

至少4亚基构成？一条多肽链？

聚合

3‘5’外切酶活性

参与DNA损伤修复

21

（三）DNA聚合酶Ⅲ

DNA复制的主要酶

10种亚基组成,不对称二聚体，称DNA聚合酶III全酶

MW900KD

（1）非常高的续进性（processivity)>500,000nt

（2）催化活性高>1000nt/秒

（3）3‘5’外切酶活性

2223

聚合功能校读功能环绕DNA钳35

+核心聚合酶x2+2+2'DNA聚合酶III*+4

全酶242526

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ的亚基组成及功能

亚基全酶的亚基分子量功能

亚基数(kDa)

α2132聚合酶活性

ε2273′→5′核酸外切酶活性核心酶

θ210

τ271稳定模板结合，核心酶二聚作用

γ252

δ135

δ′133单个运载β亚基DNA的夹钳复合物

χ115

ψ112

β437最适续进性要求的DNA夹钳

272829

大肠杆菌DNA聚合酶的比较

名称PolⅠPolⅡPolⅢ

亚基(不同类型数)1≥4≥10

分子量(kDa)10388~900

3′→5′+++

核酸外切酶活性

5′→3′+--

核酸外切酶活性

聚合速率（核苷酸/秒）16~20~7250~1000

续进性（聚合酶3~200≥10000≥500000

解离前加入的核苷酸）

功能填补空隙

切除引物

DNA修复DNA修复DNA复制

30

DNA复制系统或复制体(replisome)

是与DNA特殊结构结合的蛋白质的复合物

有20或更多不同的酶和蛋白质

在复制叉工作，不以独立单位存在

当复制体沿着DNA移动，亲代DNA解链，子代DNA链合成

31

二、引物酶和引发体

引物酶是dnaG基因的产物，60kD的单链多肽

引发体（primosome）

由多种蛋白质和酶组成，DNA复制起始所必需

最早大肠杆菌复制研究中

DnaA辨认其始点

DnaB解链酶

DnaC运送和协同DnaB

DnaG引物酶（primase）合成RNA引物

32

三、DNA连接酶(DNAligase)

催化DNA链的5′磷酸根与另一段DNA链的3′-OH形成磷酸二酯键

病毒和真核细胞的DNA连接酶，需ATP

来自细菌的，需NAD+

3334

四、解链、解旋的酶类和蛋白质

35

(一)

DNA解链酶(DNAhelicase)

ATP酶活性

2ATP/bp

rep蛋白和某种解链酶的协同作用，使DNA双链得以解开

3637(二)单链DNA结合蛋白

single-strandedDNAbindingprotein，SSB

螺旋去稳定蛋白

helixdestabilizingprotein，HDP

维持模板单链状态

避免核酸酶水解

大肠杆菌SSB74kD四聚体

38

(三)

拓扑异构酶

(topoisomerase，Topo)

TopoⅠ

切断DNA双链中的一股，封口，松弛负超螺旋

3940

TopoⅡ（旋转酶gyrase）

（1）

切断DNA双链，使另一DNA双链经过此切口，封

口，正超螺旋转变为负超螺旋

（2）使连锁着的两个DNA超螺旋分开

414243

第三节DNA复制过程

一、复制的起始

大肠埃希菌复制

特定起始位点oriC245bp

3个13bp串联序列GATCTNTTNTTTT

出现11次GATC

4个9bpDnaA结合位点TTATCCACA反向重复

4445

至少有8个不同的酶或蛋白质参与

DnaA蛋白

结合到4个9bP重复序列上，并使富含A-T的3个13bp重复序列的DNA变性

ATP

细菌组蛋白样蛋白（histonelikeproteinHU）

促进起始

DnaB解链酶

DnaC辅助DnaB作用

4647

形成引发前复合物

(preprimingcomplex)

SSB结合到单链DNA并使之稳定

拓扑异构酶Ⅱ松弛DnaB解链酶解

链产生的拓扑张力

48

二、复制的延长

DNA解链酶

拓扑异构酶

SSB

前导链合成与复制叉DNA解链的位置保持一致，连续地进行

随从链合成是以与复制叉移动相反的方向合成冈崎片段

E.coli前导链和随从链的合成偶联

4950515253

表参加大肠杆菌DNA复制的蛋白质及其功能

蛋白质分子量亚基起始延长功能

kDa

DnaA521+识别起始顺序,在起始点

特异位置打开双链

DnaB3006*++解DNA双链

DnaC291++辅助DnaB结合到起始点

HU192+DNA结合蛋白，促进起始

引物酶(DnaG蛋白)601++合成RNA引物

SSB75.64*++结合稳定单链DNA

RNA聚合酶4545+促进DnaA活性

DNA拓扑异构酶Ⅱ4004++解除DNA解链产生的

扭转的张力

DNA聚合酶Ⅲ90020+新链延长

DNA聚合酶Ⅰ1031+填补空隙，除去引物

DNA连接酶741+连接DNA链3ˊ-OH与

5ˊ-P缺口

DNA拓扑异构酶Ⅰ1004+松弛负超螺旋

Rep651+DNA解链

DNA解链酶Ⅱ751+DNA解链

*在复制起始时亚基是相同的

54

三、复制的终止

终止点(terminus,Ter)

终点部位含有多拷贝20bp的序列以二组相反方向排列，形

成短的夹子

Tus蛋白质终止点利用物质（terminusutilizationsubstance)

结合位点

Tus-Ter复合物从一个方向阻止复制叉

Ter序列最后被复制5556连环物(catenanes)

两个环状染色体拓扑连接

拓扑异构酶Ⅱ

分离连环物和线性子代染色体

其它环状染色体复制的终止是类似的

5758

第四节

真核细胞的DNA复制

一、DNA复制需要的酶和蛋白质

1、真核细胞DNA聚合酶

哺乳动物DNA聚合酶

α，β，γ，δ，ε5种

无5′→3′外切酶活性

59DNA聚合酶α多亚基酶

一个亚基有引物酶活性

最大的亚基（Mr~180000）有聚合酶活性

无3′→5′外切酶活性

合成随从链60

DNA聚合酶δ二个亚基

3′→5′核酸外切酶活性，校正功能

聚合酶活性

前导链合成

61增殖细胞核抗原

(proliferatingcellnuclearantigen，PCNA)

Mr29000,三聚体

与DNA聚合酶δ结合，促进其活性

形成环状的夹钳

增强DNA聚合酶δ续进性62

DNA聚合酶ε

类似于DNA聚合酶Ⅰ的作用

修复

切除RNA引物

63

DNA聚合酶β

DNA修复中起作用

DNA聚合酶γ

线粒体DNA复制

64复制因子RPA和RFC的蛋白质复合

RPA真核单链DNA结合蛋白，类似SSB

RFC夹钳PCNA的运载物（clamp-loader）或媒

介物（matchmaker）

促进活性的复制复合物的组装

65

真核生物DNA聚合酶的比较

名称αβγδε

聚合活性+++++

5′→3′

核酸外切酶活性--+++

3′→5′

细胞核++-++

线粒体--+--

功能填补空缺DNA线粒体前导链DNA

随从链修复DNA合成合成修复

合成切除引物

66

2端粒酶(telomerase)

端粒(telomere)

是线性真核染色体末端的序列,含有许多短的寡核苷酸序列的串联重复

端粒长度

某些有纤毛的原生动物几十bp

哺乳动物好几万bp

67

端粒DNA的3‘端有数百个串联重复GT丰富的短的寡核苷酸序列

四膜虫GGGGTT

人AGGGTT

酵母约100bp的TxGy重复序列x和y一般1~4

68

端粒酶

特异的逆转录酶，含有RNA和蛋白质，合成端粒

RNA含有CyAx重复序列,作为端粒

TxGy链合成的模板

蛋白质逆转录酶的催化活性

6970

母链

5´3´

3´5´

未复制端粒酶

完全的子链（不需DNA模板）

5´（TTGGGG）nTTGGGG

3´5´

3´OH

DNA聚合酶

（需DNA模板）

5´（TTGGGG）nTTGGGG

3´5´（AACCCC）nAACCC

DNA连接酶

核酸酶

5´（TTGGGG）nTTGG3´

3´（AACCCC）nAAC5´

图端粒延长的可能机制

71

哺乳动物

端粒末端形成大的环状结构

环状DNA与TRF1和TRF2的蛋白质结合

TRF2蛋白催化环的形成

保护染色体DNA3′端的稳定

不被核酸酶降解

7273

人体端粒长度与细胞衰老

生殖细胞、快速分裂的体细胞，如干细胞有端粒酶活性，端粒长度维持

体细胞缺乏端粒酶，端粒长度不维持

端粒缩短与年龄呈相反关系

端粒酶特异的抑制剂

作癌症治疗剂

74

第五节

DNA损伤的修复

7576

突变(mutation)

DNA的核苷酸序列永久的改变

置换突变转换颠换

插入或缺失突变

DNA修复(repair)系统

7778一、碱基错配修复（mismatchrepair）

模板链甲基化标记

能辨别模板链和新合成链

E.coli至少含有12种蛋白质参与

79

Dam甲基化酶（DamMethylase）

催化DNA中GATC序列内腺嘌呤N6位置甲基化

GATC序列以相反的方向出现在两条链

复制后有短暂间隔时间

模板链甲基化

新合成链还未被甲基化。

8081

MutL蛋白与MutS蛋白形成复合物

结合到错配的碱基对（C-C配对除外）

MutH蛋白

结合到MutL和GATC序列

有位点特异的核酸内切酶活性

在GATC中G的5′端的未甲基化链进行酶切

8283

DNA解链酶Ⅱ

单链结合蛋白结合作用

核酸外切酶Ⅰ

除去在切点与错配碱基位点之间的新链的片段

DNA聚合酶Ⅲ催化合成空缺

DNA连接酶封口

84

CH3

CH3

ATP

DNA解链酶Ⅱ，SSB

ADP+Pi

核酸外切酶Ⅰ

CH3

CH3

DNA聚合酶Ⅲ

DNA连接酶

CH3CH3

图完成碱基错配修复

85

细菌碱基错配修复

能量消耗特别昂贵

长链片段的降解和替换

说明DNA修复对细胞的重要性

86

人遗传非息肉结肠癌综合症

缺陷hMLH1、hMSH2基因

分别编码大肠杆菌Mut和MutS蛋白质的人的同源蛋白

结肠癌幼年产生

综合症发生率1/200

87

二、碱基切除修复（base-excisionrepair）

DNA糖苷酶（DNAglycosylase）

缺嘌呤或缺嘧啶的位置（apurinic-orapyrimidinic-site，

APsite）

至少有20种不同的DNA糖苷酶

88

修复步骤：

（1）DNA糖苷酶识别损伤碱基,切割

（2）AP核酸内切酶切AP位置附近磷酸二酯键

（3）DNA聚合酶Ⅰ除去损伤链，合成新DNA链

（4）DNA连接酶封口

8990

三、光修复

“光修复酶”(photolyase)

含二个辅助因子作光吸收剂或生色基团

大肠杆菌和酵母FADH－

叶酸

9192

四、切除修复(excisionrepair)

关键修复途径

E.coli

ABC核酸切割酶(ABCexcinuclease)

UvrA(Mr104000)

UvrB(Mr78000)

UvrC(Mr68000)

93

修复步骤：

（A2B）结合到DNA损伤部位，A2分离

UvrC结合到UvrB

UvrB切割损伤3′端第5个磷酸二酯键

UvrC切割损伤5′端第8个磷酸二酯键

UvrD解链酶除去损伤片段

DNA聚合酶Ⅰ填补空缺

DNA连接酶封口

9495

真核细胞切割核酸酶

与细菌的酶完全类似，含16个多肽

水解产生27-29个核苷酸片段

（5’第22，3‘

第6）

DNA聚合酶ε填补空缺

DNA连接酶封口

人类“着色性干皮病”

(xerodermapigmentosum)

9697五、O6-甲基鸟嘌呤的直接修复

(directrepairofo6

-methylquanine)

烷化剂:硫酸二甲酯等

鸟嘌呤的O6

O6-甲基鸟嘌呤

复制时发生错配

G-C

G-T

9899100

甲基转移酶(methyltransferase)

催化O6-甲基鸟嘌呤上甲基转移到酶蛋白Cys残基之一上

不可逆酶被永久地甲基化而失活

自杀修复(suiciderepair)

101102

六、重组修复(recombinationrepair)

DNA分子损伤面较大缺乏切除修复酶系

103

损伤部位

片段交换

图重组修复104

七、SOS修复(SOSrepair)

DNA聚合酶Ⅱ

特异性低,造成较广泛突变

错误倾向的修复(error-pronerepair)

突变杀死许多细胞

105UvrABC活性依赖于recA蛋白

lexA蛋白抑制蛋白(repressorprotein)

抑制与SOS修复有关基因表达

lexA蛋白水解基因抑制被解除

106

lexA蛋白

SOS修复有关基因(被抑制)

蛋白质水解作用

ssDNA-recA

被水解的lexA蛋白

SOS修复有关基因（活化）

表达

recA蛋白UvrABC核酸酶其他SOS修复酶系

图SOS修复

107

修复辐射或者化学致癌剂引起DNA损伤

产生错误倾向是永久突变

与细胞癌变有关

着色性干皮病患者易患皮肤癌

SOS修复108

“毛细血管扩张性失调”

(ataxiatelangiectasia)

x,

射线敏感易患淋巴瘤

约10%乳腺癌与遗传缺陷Brca1、Brca2基因有联系

BRCA1、BRCA2蛋白:recA蛋白的真核同源蛋白

乳腺癌发生率大于80%

109

第六节

DNA的重组

一、同源DNA重组

两个DNA的序列同源，通过链断裂和片段的交换重接，改变了基因的组合和序列

110

（一）Holliday模型

Holliday1964年提出

Meselson和Radding1975年修正

111

同源Ⅰ3΄5΄

5΄3΄

同源Ⅱ5΄3΄

3΄5΄

断裂，合成3΄5΄

5΄3΄

5΄3΄

3΄5΄

形成袢状3΄5΄

5΄3΄

5΄3΄

3΄5΄

切除，封口3΄5΄

5΄3΄

5΄3΄

3΄5΄

链交叉5΄3΄

3΄5΄

3΄5΄

5΄3΄

形成异源双螺旋区5΄3΄

3΄5΄

3΄5΄

5΄3΄

图Holliday重组模样(Meselson-Radding修正)

1125´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´3´5´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´3´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´内切酶

(recBCD)DNA侵扰(recA)分支迁移

(recA)

内切酶(recBCD)

DNA

连接酶Holiday中间体113Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´5´5´3´3´3´内切酶(ruvC)5´5´5´5´3´3´3´3´DNA连接酶5´5´5´5´3´3´3´3´内切酶(ruvC)5´5´5´5´3´3´3´3´DNA连接酶5´5´5´5´3´3´3´3´片段重组体拼接重组体114（二）recA蛋白在DNA重组中的作用

recA蛋白催化DNA重组反应115

被替代出的链

ATPADP

recA蛋白

单链DNA被结合进

双螺旋的链

DNA双链D环中间产物

图recA蛋白催化DNA重组反应

116recA蛋白在DNA上合作组装为一条螺旋状纤维(右手螺旋)直径约10nm，每圈螺旋包含6.1~6.2个单体，单链DNA被裹在纤维中央，约每3个核苷酸相当于1个recA蛋白单体(38kD,352aa)

单链DNA-recA蛋白多聚体(ssDNA-recA)是recA蛋白的活性形式

117118

recA蛋白

ADP+Pi

ssDNA

ATP