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第七章酵母菌的基因工程DividingSaccharomycescerevisiae(baker’syeast)cells①能在E.coli中克隆和扩增。一.酵母克隆载体Leu2+、His+、Ura3+、Trp1+;④

有合适的克隆位点。③

有酵母的选择标记Ori

②有大肠杆菌的选择标记Ampr、Tetr。由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片断（选择标记）构成。ColE1酵母Leu2+如PYeleu10:（1）整合型载体(YIp)

①转化率低（1-10转化子/微克DNA）。特点：载体上只有细菌的复制区，没有酵母的自主复制区。可与受体细胞的染色体DNA同源重组，随染色体一起复制。②不能在酵母细胞中自主复制③整合到酵母的染色体上④不能从酵母细胞中提取载体。由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片断(选择标记和酵母DNA自主复制顺序ARS）构成。大肠杆菌质粒酵母ARS

（2）复制型载体(YRp)

酵母选择标记

ARSARS（automouslyreplicatingsequence）:ATTTTATATTTATGT250bp保守区特点：①转化率高（102-103转化子/微克DNA)。④不稳定，容易丢失。②可从大肠杆菌和酵母中提取质粒。既能在大肠杆菌中复制，又能在酵母细胞中自主复制。③穿梭载体（shuttlevector）在YRp质粒中插入酵母染色体的着丝粒区。特点：YRp质粒酵母着丝粒（3）着丝粒质粒(YCp)

③不易从细胞中提取。①行为像染色体，能稳定遗传。②单拷贝存在。由大肠杆菌质粒、2

m质粒及酵母染色体DNA选择标记构成。大肠杆菌质粒酵母选择标记

2

m质粒如pYF92:pBR3222

m酵母his3+（4）附加体型载体(YEp)

2

m质粒：酿酒酵母的内源质粒，长度是2

m。含有自主复制起始区ori和STB序列（使质粒在供体中维持稳定）。特点：①很高的转化活性（103-105转化子/微克DNA）.②拷贝数多（25-100分子/细胞）。③比YRp稳定。YEp24Leu-

酵母原生质体感受态酶去壁CaCl2、PEG整合到染色体上，或独立在酵母细胞内转化Leu营养缺陷型培养基筛选转化子克隆生长酵母载体大肠杆菌提取插入外源基因鉴定克隆发酵表达外源基因产物分离、纯化二.酵母转化和表达的一般过程

大多数是以酵母菌氨基酸或碱基合成途径中的结构基因作为选择标记，如lue2，trp1，his3和ura3

。使用这些遗传标记时，受体菌应是相应标记基因的突变型，且是稳定的突变体（缺失突变或多点突变），利用遗传互补进行转化体选择的。组氨酸his3—咪唑磷酸甘油脱氢酶;亮氨酸lue2—β-异丙基苹果酸脱氢酶;赖氨酸l

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