重组甘露醇-1-磷酸脱氢酶的分离纯化和鉴定

重组甘露醇-1-磷酸脱氢酶的分离纯化和鉴定

ppt演讲：ppt制作：组员：目录实验目的实验背景和主要原理实验试剂实验步骤预期结果实验目的了解包涵体内蛋白质分离纯化的基本原理和操作学习亲和层析的基本原理和操作方法学习蛋白质含量的测定方法学习酶活性的测定方法和操作实验背景和主要原理甘露醇-1-磷酸脱氢酶(MTLD)是甘露醇类渗透保护剂的生物合成关键酶。我们组在之前的《基因工程实验技术》课程中构建了甘露醇-1-磷酸脱氢酶表达菌。成功构建重组表达质粒pET-28a(+)/MTLD，并转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)感受态细胞，已获得能大量表达生甘露醇-1-磷酸脱氢酶的重组体克隆。本实验项目为自选课题，主要内容为重组甘露醇-1-磷酸脱氢酶的分离纯化、鉴定和活性测定。Fructose-6-phosphate(F6P)Mannitol-1-phosphate(M1P)MannitolATPFructoseHexokinase(HK)Mannitol-2-dehydrogenase(M2DH)NAD(P)+Mannitol-1-phosphatephosphatase(M1Pase)Mannitol-1-phosphatedehydrogenase

(M1PDH)ADPNAD(P)HPiNAD+NADH渗透保护剂细胞内蛋白质分离的基本步骤是：清洗细胞、裂解细胞、离心去除膜组分等获得可溶性蛋白质，然后通过盐析、层析等方法进行分离纯化，以获得蛋白产物。分离纯化的情况可用SDS电泳检测。如果目标产物表达后形成包涵体，包涵体蛋白的分离需要经过细胞破碎、收集包涵体、洗涤包涵体（去除吸附在蛋白质表面的不溶性杂蛋白和其它杂质）、包涵体变性溶解和变性蛋白质的复性等步骤，再进行与一般蛋白质相同的分离纯化。用pET-28a质粒载体构建的蛋白表达产物中，目标蛋白与载体上设计的组氨酸标签融合表达，可以用镍柱进行金属离子亲和纯化。金属离子亲和层析是利用金属离子的络合物或形成螯合物的能力（如镍）吸附蛋白质的分离系统。金属鏊合介质预装柱（镍柱）

镍柱分离蛋白原理图材料、试剂1实验材料重组甘露醇-1-磷酸脱氢酶甘油菌（载体pET-28a，受体菌E.coliBL21）2实验试剂咪唑、卡那霉素（Kan）、IPTG（异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）、去垢剂TritonX-100、低分子量蛋白质Marker总提取路线

甘露醇-1-磷酸脱氢酶的诱导表达

细胞超声破碎

包涵体的清洗包涵体的变性溶解

镍柱纯化LDH洗脱条件优化镍柱纯化LDH

检测方法

蛋白含量测定

酶活性测定

SDS电泳鉴定

甘露醇-1-磷酸脱氢酶的诱导表达甘油菌

LB液体培养基中培养活化6h

按1：100接入锥形瓶中培养IPTG

诱导4h

SDS电泳卡那霉素细胞超声破碎

离心15min

蒸馏水清洗3次

收集菌体

BufferI悬浮超声破碎40min

离心10minSDS电泳去上清上清沉淀目的蛋白的存在部位包涵体的清洗超声波破碎液

离心10min

沉淀

BufferⅠ清洗

BufferⅡ清洗

沉淀振荡0.5h

（37℃）离心10min

沉淀

BufferII清洗

沉淀

蒸馏水清洗

沉淀

注：包涵体变性前必须通过

清洗尽可能去除杂质去上清

包涵体的变性溶解

清洗后的包涵体沉淀用10mL尿素变性液（50mMTris-HCl，8M尿素，pH8.0）悬浮，