遗传学实验：实验九 DNA的PCR扩增及其产物纯化

实验九DNA的PCR扩增及其产物纯化一、实验目的了解聚合酶链式反应(PCR)的原理掌握PCR实验的方法PCR结果的检测了解用硅胶膜选择性吸附柱纯化DNA的原理掌握用硅胶膜选择性吸附柱纯化DNA的方法二、实验原理(一)PCR的原理

PCR是以单链DNA为模板，四种dNTP为底物，利用寡核苷酸引物与模板3’端的特异性结合，在DNA聚合酶的催化下合成模板的互补链PCR反应通常包括25-30个循环，每个循环由变性、退火、延伸三个步骤组成。假定扩增效率为1，经过30个循环后，目标DNA分子数将提高到起始时的1073741824倍（即230倍）时间(min)557294温度(℃)第n个循环变性退火延伸延伸变性Y=X(1+E)NY:扩增后目标DNA分子数；X:起始时目标DNA分子数；E:扩增效率(0≤E≤1)；N:扩增循环数（在理想条件下）…………….....……………………..……5’-3’--3’-5’(二）引物设计正向引物(Forward)→←反向引物(Reverse)正向引物：TCATTCTCTGATCCGTGCAG1.对引物的一般要求(1)长度一般为18-27nt(2)GC含量为40-60%(3)引物在模板内没有其它高度相似的序列(4)引物间和引物内不形成二聚体及发夹结构(5)引物之间的Tm值应基本相同（Tm估计值与计算方法有关）(6)3’端避免出现3个及以上连续的相同碱基反向引物：AGGCAAGCTTTTCCTTCACA3.引物设计工具（1）引物设计软件

Oligo6.44

PrimerPremier

5.0

Dnastar（2）网上引物设计工具

Primer3

/primer3/input.htm2.

DNA序列的来源

（1）查询序列数据库（2）查阅科技文献（3）测序TheNationalCenterforBiotechnologyInformation（http://www.ncbi.）例1：查询Spinaciaoleraceaactingene序列2023/10/13/primer3/input.htm例2：利用Primer3设计引物①复制和粘贴DNA序列①②②③②勾选所需的引物③获取引物PCR的技术关键引物设计、引物保存、防止污染、反应条件优化、……PCR的衍生技术反转录PCR、反向PCR、巢式PCR、原位PCR、多重PCR、多重等位基因PCR、不对称PCR、锚定PCR、荧光定量PCR、……PCR的应用基因克隆、DNA测序、定点突变、基因分型、疾病诊断、亲子鉴定、嫌犯验证、转基因检测、基因表达水平分析、……PCR产物电泳(照片）酶切产物电泳（示意图）(三)PCR产物检测的方法M127384562000bp750bp100bpM12738456PCR产物电泳(照片）酶切产物电泳（示意图）(三)DNA胶回收的原理与方法用特殊吸附膜选择性吸附核酸分子，去除其他杂质。M2000bp1000bp750bp500bpDNA长度：50bp～20kb回收率：50～80％回收量：≤20μgDNA质量：可直接用于连接、PCR、测序离心柱收集管硅胶膜选择性吸附柱在高盐和pH≤7的条件下，DNA能被硅吸附，而利用低盐和pH≥7的洗脱液可以将DNA从硅上洗脱三、实验材料和试剂(一)PCR扩增

1.模板：菠菜(Spinaciaoleracea)基因组DNA2.引物：Fw:20nt,Re:20nt.（序列略）

3.试剂盒：即用PCR扩增试剂盒(上海生工）(二)DNA纯化

Sanprep柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工）1.ddwater2.缓冲液buffer(pH8.3)3.Mg++(0.5-2.5mM)4.dNTPs(0.2mM)5.TaqDNA聚合酶(1.0-2.0U)6.DNA模板(30-100ng)上下游引物primer(10-50pmol)PCR反应体系2XPCRMaster四、实验步骤（请参考实验指导书）(一)PCR扩增（每人做1管）

1.冰上配制反应液

ddwater

22μl2XPCRMaster25μl模板DNA1μl引物2μl

总体积

50μl(1)混匀(2)在管上做好标记（统一编号）(3)放入PCR仪中扩增←菠菜基因组DNA←正、反向引物已预混PCR边缘效应：PCR仪边缘各孔的扩增效果稍差111213121222323132333414243451525356162636717273781828389192939102030402.PCR反应条件

（由教师设置）95℃5分钟95℃20秒55℃20秒72℃20秒72℃10分钟4℃30分钟循环30次预变性变性退火(模板～引物)延伸(0.8-1min/kb)保温降温(暂时保存)(二)PCR产物的凝胶电泳将目的片段与其它片段分开(三)PCR产物的硅吸附柱纯化切割目标片段胶块,称重放入1.5ml离心管50度水浴5-10min加入3-6倍BufferB2溶液移入吸附柱吸附柱装入新1.5ml离心管吸附柱中加300μlBufferB28000rpm

30秒加30μlElutionbuffer静置2分钟，9000rpm

1分标记-20℃保存（每人做1管）8000rpm,30秒空