利培酮抗精神分裂症的实验研究

利培酮抗精神分裂症的实验研究

随着人类社会经济的发展和人们生活水平的提高，精神和心理问题变得越来越重要。医学专家认为:人类已经从“传染病时代”、“躯体疾病时代”步入了“精神疾病时代”,精神卫生事业面临着新的挑战。精神分裂症是世界上十大致残或使人丧失劳动能力的疾病之一,也是各种精神疾病中患病率最高的一种。精神分裂症作为影响脑神经高级思维功能的病变,是对人的思维及工作能力最具威胁力的一种疾病,也是一个严重的社会问题,因此精神分裂症被描述为最严重的影响人类的疾病。精神分裂症的病因未明,具有感知、思维、情感、行为等多方面的障碍和精神活动的不协调以及精神活动与环境不协调的症状。据美国精神病协会编辑的精神病的诊断与统计手册(第三版)的描述,精神分裂症患者的常见症状为:思维紊乱、幻觉、错觉、社交退缩和紧张状的行为。随着社会竞争压力的增加,精神分裂症的患病率有日益升高的趋势,但由于目前对其发病机制和分子细胞生物学基础缺乏了解,在临床诊断上只能依靠其精神症状而缺乏生物学检验指标。当前世界上迫切需要开拓一条在研究方法学上有突破的新路,用以研究精神分裂症的发病原因,生物学机制以及相关药物的开发。动物模型的建立是精神分裂症及其药物研究首要的关键问题。虽然长期以来研究者们也试图通过干扰动物生存环境如噪声刺激、强光刺激、破坏生物节律等方法建立一些动物模型用于精神疾病的研究,但由于这些模型的分散性和局限性以及缺乏一定的理论基础,而使这方面的研究难以解释精神分裂症的发病机制并推进相关药物的开发。近来随着神经科学的发展和临床研究的日趋细致,使精神病动物模型的建立有了一定的理论基础,建立方法也开始从单一的环境干扰法向多样化发展,其中药物诱发是目前比较有发展前途的方法之一。例如,大鼠及小鼠经过药物诱发出现的类似精神分裂症的症状,如表现为明显增加了移动加快(hyperlocomotion)及单调的刻板性动作(stereotypy)、社交退缩(socialwithdrawal)和情感淡漠(flataffect)。多年来,国内外科学界对精神分裂症进行了广泛的探索,尤其在近一二十年里,人类对精神分裂症的认识有了明显的提高,提出了各种在一定范围内有效的假说。比较流行的是多巴胺功能亢进假说和5-羟色胺能假说,并在此基础上设计了相应的药物。但这些药物并不能根本解决问题,而且干扰中枢神经系统的基础调节系统大多产生较为严重的锥体外系副作用,因此还可能有其它的系统参与。近年来,精神分裂症的谷氨酸功能紊乱假说渐渐被人们所接受,并正在被越来越多的实验所证实。基于精神分裂症的谷氨酸功能紊乱假说,作者利用N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)非竞争性受体拮抗剂MK801(5-甲基二氢二苯并环庚稀亚氨马来酸,地卓西平马来酸盐)作用于具有不同遗传背景的3个实验小鼠品系,初步建立了精神分裂症动物模型,并采用目前临床上常用的抗精神分裂症药物利培酮作用于模型小鼠,发现利培酮能显著地抑制模型小鼠的类似精神分裂症的症状。这一研究为证实动物模型与精神分裂症的相关性,进一步寻找精神分裂症相关因素,以及为筛选新药打下了基础。1材料和方法1.1实验动物的制备地卓西平马来酸盐(简称MK801,美国TOCRIS公司生产)和利培酮(美国JANSSEN制药公司生产)分别溶解于含0.9%NaCl的生理盐水中,用逐步稀释法配制各个剂量的溶液。1.2实验动物近交系BALB/c小鼠,近交系C57BL/6小鼠和远交群ICR小鼠,均为雄性,体重(20±2g),SPF级,购自中国科学院上海实验动物中心。合格证号:中科沪动管第99-003号。1.3ldph机组旷场跑动行为红外线检测系统(FlexFieldSystem),美国SanDiegoInstruments公司产品;松下摄像系统;Hamilton微量注射器(250μl)等。1.4玻璃的覆盖实验用不同剂量的MK801溶液对实验小鼠进行腹腔注射,随即将小鼠放置于48cm×24cm×20cm顶部开口的长方形实验盒内,盒上覆盖玻璃。实验盒底部虚拟划分为8个大小相同的区域,旷场跑动行为红外线检测系统以小鼠是否阻断红外线来自动检测记录每单位时间(如15s)内小鼠进入各个区域的次数,分别作出整个检测期间(如4h)移动行为的剂量效应曲线和各个剂量的时间效应曲线。1.5无规则的条纹运动,如反复转圈、小范围内内部用系列剂量MK801作用于小鼠,能产生类似精神分裂症的刻板性动作症状,与对照组相比有明显增强的呆板和非自主的刻板性动作,如反复摇头、转圈、小范围内不停的无规则运动等。对给药后的实验小鼠摄像数小时,然后由2-3名技术人员评定记录小鼠在每5min的第1min内呆板和非自主刻板性动作的累积时间,分别作出整个检测期间呆板和非自主刻板性动作的剂量效应曲线和各个剂量的时间效应曲线。本实验的技术人员在正式实验前进行统一标准的训练。1.6实验小鼠的速度和时间用0.6mg/kg剂量的MK801溶液腹腔注射实验小鼠,30min后同侧腹腔注射系列剂量的利培酮,随即检测记录其移动行为和摄像数小时,并如前所述统计刻板动作(stereotypy)的时间。1.7统计分析将实验组的行为学数据与对照组比较,并以t检验法进行生物学统计分析。2结果2.1对小鼠分组的影响选用近交系BALB/c小鼠作为建立精神分裂症模型的首选实验动物。作者设计了生理盐水(saline,简称sal)对照组和浓度分别为0.15、0.3、0.6、1.0、2.0和10mg/kg6个剂量组的MK801溶液,每个剂量组采用10只小鼠,分别以100μl/20g小鼠体重的注射量于左侧腹腔注射,然后用旷场跑动行为红外线检测系统实时检测、记录其移动行为,并同步摄录小鼠的活动情况,记录小鼠的刻板性动作,分别比较MK801各个剂量组在两项量化指标方面的差异。2.1.1对小鼠的行为影响从图1A和B可以看出,在给药后的2.5h中,低剂量组0.15mg/kg的MK801对小鼠的移动行为无明显的影响;中等剂量组0.3、0.6、1.0mg/kg的MK801能明显增加小鼠的活动,2mg/kg的MK801对小鼠的移动在前半期有所抑制而后半期有所增加(图1A),因此累积移动行为效应无明显影响(图1B)。更需要指出的是:该剂量组的移动方式与生理盐水对照组有着本质的区别,该组的方式主要是呆板、单调和非自主的刻板性动作;高剂量组10mg/kg的MK801明显使小鼠的移动减少。总体看来,MK801对移动的剂量效应呈钟形效应(图1B)。另一方面,从图1A看,中等剂量组0.3、0.6、1.0和2mg/kgMK801的移动效应的峰值时间点的迁移呈剂量依赖性变化,即剂量越高其峰值效应出现时间越迟。2.1.2给药后ml801的诱发症状效应从图1C和D可看出,对照组和低剂量组0.15mg/kg的MK801没有诱发小鼠产生精神分裂症的典型症状,即呆板、单调和非自主的刻板性动作;而中等剂量组0.3、0.6、1.0和2.0mg/kg的MK801呈剂量依赖性诱发出刻板性动作;在给药后的2.5h内,高剂量组10mg/kg的MK801诱发的症状效应趋于饱和的效应状态。从药物起效应的时间来看,MK801中等剂量组中的0.3mg/kg组起效应的时间稍晚,给药后约10min才诱发出类似精神分裂症的症状,而MK801高于0.3mg/kg的剂量起效时间都在5min左右。2.1.3小鼠移动行为的稳定性作者绘出小鼠腹腔注射MK801后0.5-1h的关于类似精神分裂症的症状的量效曲线图。从图2A和2B可以看出,在给药后的0.5-1h内,小鼠的移动行为效应随剂量的增加而呈峰形变化;而精神分裂症的另一症状:刻板性动作,则随剂量的变化呈典型的S形变化。2.2小鼠的注射盐水对利培酮的敏感性注射行为利培酮(risperidone简称ris)的药物起效时间要晚于MK801,因此作者在对BALB/c小鼠腹腔注射MK801(简称MK)前0.5h(剂量:0.6mg/kg,注射量:100μl/20g体重),先对不同组的受试小鼠分别注射生理盐水0.05、0.1、0.25、0.5和5mg/kg5个剂量的利培酮,对精神分裂症模型组先行注射生理盐水,并设立了在注射生理盐水0.5h后再次注射生理盐水的无药物对照组。然后记录,观察和分析抗精神分裂症药物利培酮对0.6mg/kgMK801致BALB/c小鼠精神分裂症模型的作用。2.2.1利培酮对小鼠移动能力的影响从图3A和B看,0.05和0.1mg/kg利培酮能明显地抑制精神分裂症模型组小鼠的移动能力;0.25、0.5和5mg/kg利培酮几乎使精神分裂症模型组小鼠完全处于不动状态。2.2.2利培酮对balb/c品系模型小鼠的影响从图3C和D看,0.05、0.1、0.25、0.5和5mg/kg利培酮对模型小鼠的刻板性动作的抑制程度随剂量的增加而逐渐增强,直到模型小鼠处于完全不动状态。总而言之,利培酮对BALB/c品系模型小鼠的类似精神分裂症症状有明显的抑制作用。0.05和0.1mg/kg的利培酮使精神分裂症模型小鼠的移动能力恢复到接近正常水平;而0.25和0.5mg/kg的利培酮能明显抑制精神分裂症模型小鼠的刻板性动作,使小鼠处于静止状态。2.3c7bl/6小模型用近交系C57BL/6小鼠重复了BALB/c小鼠的上述实验,观察到同样能产生类似精神分裂症的症状,并用利培酮验证了对C57BL/6小鼠精神分裂症模型的作用。结果表明:利培酮对C57BL/6品系模型小鼠的类似精神分裂症的症状同样具有明显的抑制作用。尤其是0.25和0.5mg/kg的利培酮既能抑制类似精神分裂症的症状,又能使精神分裂症模型小鼠的移动能力恢复到接近正常水平(图略)。2.4小鼠热行为检测作者进一步将远交群ICR小鼠作为建立精神分裂症模型的实验动物,设计了对照组和浓度分别为0.15、0.3、0.6、1.0和2.0mg/kg5个剂量组的MK801溶液,每个剂量组用10只小鼠,同样分别以100μl/20g体重的注射量注射于小鼠左侧腹腔,用旷场跑动行为活动检测系统同步检测记录其移动行为,并同步摄录小鼠的活动情况,用以分析统计小鼠刻板性动作。然后,统计比较MK801各个剂量组在两项精神分裂症量化指标上的差异。2.4.1剂量依赖的影响从图4A和B可以看出,在给药后的4h内,MK8010.15-0.6mg/kg的3个剂量导致小鼠产生的移动亢进累积效应,明显地呈剂量依赖性增强;而MK8010.6-2mg/kg的3个剂量则导致小鼠产生的移动亢进累积效应趋于饱和。另一方面,从图4A看,0.3、0.6、1.0和2mg/kg剂量的MK801诱发ICR小鼠产生移动加快效应的峰值时间明显呈剂量依赖性迁移。2.4.2小鼠典型症状的线性模型从图4C和D可以看出,在给药后的4h内,对照组和低剂量0.15mg/kg的MK801没有诱发小鼠产生精神分裂症的典型症状的刻板性动作;而中等剂量组0.3、0.6、1.0和2.0mg/kg的MK801呈剂量依赖性诱发了刻板性动作。3能促进pb/c小鼠和bl/b建立精神分裂症实验动物模型,是研究精神分裂症复杂的发病机制和治疗方法的必要途径之一。作者用MK801作用于近交系BALB/c小鼠,初步建立了精神分裂症动物模型,又用近交系C57BL/6小鼠和远交群ICR小鼠进行了验证。结果表明:MK801能导致实验小鼠产生类似精神分裂症的症状,动物模型具有可重复性,稳定性较好。实验证明用MK801作用于实验小鼠建立精神分裂症动物模型是可行的。精神分裂症的主要特征为阳性症状,如幻觉、妄想、精神紊乱以及表现为阴性症状的持久性情感淡漠、注意力不集中、社交退缩及认知能力损伤。其症状在实验小鼠身上的表现,除了作者主要参照的两项典型指标——移动加快及刻板性动作外,还有其他的情感、思维和认知方面的症状表现,对其继续深入研究具有一定的可行性。关于精神分裂症的发病机制的一个主要假说是:精神分裂症的行为异常症状是由多巴胺神经递质功能障碍引起的,用于治疗精神分裂症有效的药物有一个共同的特征即阻断多巴胺受体。在许多方面,精神分裂症患者的行为与多巴胺功能亢进是相一致的,一些药物如多巴胺释放剂苯丙胺能诱发一些精神分裂症的症状;精神分裂症的发病机制的另一个假说是谷氨酸功能紊乱假说,起源于Kim等报道的精神分裂症患者的脑脊液中谷氨酸浓度低下。使用非竞争性NMDA型谷氨酸受体拮抗剂苯环己哌啶和MK801能模拟精神分裂症,而且能使精神分裂症患者的症状恶化。这些研究结果导致了用PCP和MK801来建立精神分裂症动物模型。研究表明,精神分裂症的谷氨酸功能紊乱假说与多巴胺的重要作用在精神分裂症发生和目前基于用阻断多巴胺受体的药物治疗精神分裂症并不矛盾。据报道谷氨酸和多巴胺在大脑皮层上表现出相互拮抗的作用,因此有可能是对多巴胺受体的阻断消除了谷氨酸功能低下的效应。作者的研究也证实了这种猜想,作为多巴胺受体的阻断剂,临床药物利培酮能明显地抑制BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠的MK801诱发的效应。作者认为,精神分裂症的发生不是谷氨酸功能和多巴胺功能单方面的结果而是两者的综合效应,它们的功能通路必然存在着某种联系。实验小鼠具有很多遗传背景,存在一定差异的不同品