不同类型大鼠动脉粥样硬化模型的建立及比较分析

不同类型大鼠动脉粥样硬化模型的建立及比较分析

附近杂交大鼠具有高度的纯度和遗传稳定性。这是科学研究中不可或缺的实验材料之一。HFJ近交系大鼠为河北省实验动物中心历经十余年成功培育的高繁殖力大鼠近交系。HFJ起始亲代来源于一对屏障环境下的封闭群Wistar大鼠,目前连续近亲交配已繁殖到F30代。并在后期工作中对该近交系大鼠部分表型、部分血清免疫学指标和血液生理生化指标等进行了系列研究,为HFJ大鼠的开发应用提供了大量基础资料。实验研究发现,HFJ大鼠具有自发高甘油三酯和高胆固醇特性(蔡月花等,2009;郑龙等,2012),而高血脂是动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)重要的危险诱因之一。胆固醇升高、低密度脂蛋白大量沉积是启动和加速AS的重要标志。由于AS是大多数心脑血管疾病发生的前期病理基础,并且发病机制尚未完全阐述清楚,因此选择最适实验动物,建立可靠的AS动物模型,对探讨AS发病机制和研发防治新药具有重要意义。本研究采用高脂饮食诱导法结合免疫损伤法分别建立HFJ大鼠和Wistar大鼠AS模型,通过比较分析两种大鼠AS模型的特点和差异,为HFJ大鼠是否更适用于建立AS疾病动物模型提供实验依据。1材料表面1.1动物实验动物清洁级近交系HFJ大鼠和Wistar雄性大鼠各20只,日龄30～45d,由河北省实验动物中心提供,实验动物生产许可证号为SCXK(冀)2008-1-003。动物于屏障环境+IVC条件下饲养。实验动物使用许可证号为SYXK(冀)2010-0026。饮水采用超滤处理无菌水,饲喂方式采用自由饮水和进食,人工照明各12h。动物实验过程按照“3R”原则,实验过程中给予人道关怀。采用随机数字表方法,将HFJ和Wistar大鼠按体重随机分为模型组和正常组,每组10只,实验前予以普通饲料适应性喂养1周。1.2免疫刺激处理正常组喂饲普通饲料;模型组喂饲高脂饲料(15%猪大油、2%胆固醇、0.5%胆酸钠、0.2%丙基硫氧嘧啶、2%蛋黄粉,70.3%的基础饲料),参考王园园等(2008)采用牛血清白蛋白(40mg/kg)和卵清白蛋白(2.5mg/kg)进行共免疫刺激,1周后一次性灌注维生素D3(25万U/kg)。以上动物饲料由河北省实验动物中心提供,饲料生产许可证号:SYXK(冀)2008-2-001。1.3提取物和生物工程丙基硫氧嘧啶(Propylthiouracil,PTU)购自上海朝辉药业有限公司,卵清白蛋白干粉(SigmaA5253)和牛血清白蛋白干粉(SigmaA7030)购自北京索莱宝科技有限公司,胆固醇购自北京鼎国公司,牛磺胆酸钠购自北京奥博星公司,猪油购自双汇集团,多聚赖氨酸、一抗、SP、Dab购自河北博海生物工程开发有限公司。2实验方法2.1心肌激酶和c-反应蛋白检测采用KY-190型全自动生化分析仪(南京特康生化分析仪器有限公司)进行总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)和低密度脂蛋白(LDL-C)检测,所用试剂和方法按照说明书操作,心肌激酶、心肌激酶同工酶和C-反应蛋白测定试剂盒购自中生北控生物科技有限公司。2.2大鼠主动脉及心脏组织病理学检测造模实验12周后,称重后用3%戊巴比妥钠按40mg/kg剂量对大鼠进行腹腔注射麻醉,心脏采血后立即取完整主动脉(从主动脉根部至髂总动脉分叉处)和心脏组织(取冠状沟至底部),于10%中性甲醛固定,做石蜡切片,HE染色并观察形态学改变。2.3阳性细胞观察大鼠主动脉弓用10%中性多聚甲醛固定48h(4℃),石蜡包埋,5μm切片,用SABC法对VEGF进行免疫组织化学染色。每次染色设阴性对照染色,PBS取代一抗,其他程序相同。封片后切片于400×光镜下放大观察,以细胞浆中出现条索状、颗粒状棕黄色染色为阳性细胞。染色结果判定采用免疫组化评分(IHS)方法(王园园等,2008),采用双盲法随机选择5个高倍镜视野(400×):A为阳性细胞数分级:0%～1%=0、1%～10%=1、10%～50%=2、50%～80%=3、80%～100%=4,B为阳性细胞显色强度分级:0(阴性)、1(弱阳性)、2(阳性)、3(强阳性),IHS=A×B。应用多功能真彩色细胞图像分析管理系统(美国MediaCybernetics公司Image-ProPlus)进行图像采集。2.4因素方差分析分析统计处理采用SPSS12.0软件,实验数据以x¯±sx¯±s表示,成组设计的多个样本均数比较在方差齐性的基础上作单因素方差分析,多个样本均数间两两比较采用SNK法。3结果3.1体质量在实验期间的回降趋势大鼠高脂喂养90d后处死,处死前禁食12h,称量体重,处死后快速心脏取血用于生化指标测定。HFJ和Wistar大鼠模型组与正常组相比较,体质量在实验末期差异显著(P<0.01),模型组体质量在实验后期出现回降趋势(图1)。HFJ与Wistar大鼠正常组相比较,前者TG、LDL-C水平高于后者(P<0.05),HFJ与Wistar大鼠模型相比较,TG、TC水平接近,前者LDL-C较后者升高明显(P<0.05)(表1)。3.2两组k-mb和crp的比较实验结束后对各组心肌损伤指标进行检测,CK和CK-Mb在正常组和模型组间水平差异有显著性(P<0.05),而与炎性相关的指标CRP在正常组和模型组间差异不明显(P>0.05)(表2)。3.3大鼠主动脉弓切片he染色结果大鼠心脏切片HE染色结果显示(图2),光学显微镜下观察Wistar大鼠和HFJ大鼠正常组心脏血管内膜光滑,未见增厚(图2,B、D);而Wistar大鼠模型组血管内膜增生、基层增厚,血管狭窄;HFJ模型组可见血管内皮细胞排列紊乱、基层增厚,成纤维细胞活跃,内膜下可见脂肪空泡,血管狭窄(图2,A、C)。大鼠主动脉弓切片HE染色结果显示(图3),Wistar大鼠正常组可见主动脉壁各层结构正常,内膜光滑,内皮细胞完整,中层平滑肌细胞排列整齐、无增生,中膜弹力纤维正常(图3,A、B)。HFJ大鼠正常组内膜稍有断裂,各层结构清晰完整,未见增殖病变(图4,A、B)。Wistar大鼠模型组可见主动脉弓处于AS病理Ⅱ期,由于中层平滑肌细胞嵌入内膜形成内膜纤维帽,巨噬细胞聚集到纤维帽下方吞噬脂质空泡形成泡沫细胞,纤维细胞嵌入内动下形成肌源性泡沫细胞,中层平滑肌细胞增生紊乱,部分平滑肌及弹力纤维断裂,伴泡沫细胞形成,内膜增厚并部分脱落(图3,C、D)。HFJ大鼠模型组与Wistar大鼠模型组相比,明显处于AS病理Ⅲ期,可见内膜增生、断裂,纤维帽形成,纤维帽下具有典型的胆固醇结晶裂隙,脂质空泡和片状坏死物质(以平滑肌细胞为主)形成粥糜样物质,可见典型泡沫细胞和少量淋巴细胞,中层平滑肌排列紊乱,向内膜迁移,弹力板发生断裂、崩解(图4,C、D)。3.4不同强度下内皮细胞和平滑细胞的染色结果HFJ和Wistar大鼠模型组VEGF染色阳性细胞数较正常组明显增加,棕色强度增加,内皮细胞和平滑肌细胞均呈强阳性染色,差异明显(P<0.05),具有统计学意义(表3)。HFJ大鼠模型组切片位置为斑块处,可见脂质空泡,VEGF染色阳性细胞弥漫于紊乱血管壁内,阳性细胞数较Wistar模型组多(图5)。4hfj大鼠动物模型的构建目前对于AS发病机制尚存争议,但是,多数学者认为AS与内皮细胞功能发生紊乱后的炎症反应及在此基础上的损伤-修复过程有关(赵娟,任立群,2008)。进入二十一世纪以来,AS性心血管疾病已成为严重危害人类健康的第一位杀手,其发病机制及治疗的研究一直是医学界的热点,所以建立理想的AS动物模型尤为重要。AS模型动物选择较多,如猪、猴、家兔、鹌鹑、大鼠和小鼠等,但在AS研究中各自存在优点和不足,其中家兔、基因缺陷性小鼠和大鼠应用最为广泛(傅剑云等,2009)。但是由于家兔的食性和生理解剖特点与人类差异较大,基因缺陷性小鼠价格昂贵且死亡率高,大鼠作为AS模型动物显现出明显优势。大鼠无胆囊的缺陷,可以通过在饲料中添加抑制甲状腺药物(如甲硫咪唑、甲基硫氧嘧啶和PTU等)(温进坤等,2001;刘剑刚等,2004;章义利等,2007)来提高对胆固醇的吸收能力。现在国内多应用Wistar大鼠和SD大鼠,选择多因素结合方法复制大鼠AS模型:高脂饮食诱导高脂血症并形成AS早期病变,免疫损伤或致敏方法造成血管内皮的炎性损伤,钙超载和铁超载促进动脉壁的脂质沉淀和斑块形成等。对12周龄成熟HFJ近交系雄性大鼠进行血液生化指标检测发现,TG、TC、LDL-C和VLDL-C(极低密度脂蛋白)水平均明显高于Wistar雄性大鼠(陈贵良等,2011),不同品系和性别大鼠之间血液指标存在差异已被广泛证实。血脂异常也是AS的主要诱因之一,临床上血清高TG、高LDL-C、低HDL-C是动脉粥样硬化特征性的脂质三联征(杨波等,2005)。所以利用HFJ雄性大鼠高血脂的特性,复制AS大鼠动物模型并对其适用性与Wistar大鼠进行比较研究,有可能为建立理想的AS动物模型提供方便。本实验采用高脂饮食、免疫损伤,并辅以VD3的方法进行造模。实验90d后,通过血清生化指标检测,HFJ大鼠正常组与Wistar大鼠正常组相比较TG、TC和LDL-C水平升高,说明HFJ大鼠具有自发高血脂倾向;并且HFJ大鼠模型组LDL-C及TG高于Wistar大鼠;但模型组TG水平显著低于正常组。分析其原因可能是药物影响,由于模型组应用PTU对甲状腺功能进行抑制,复制AS大鼠模型PTU的常规用量(占高脂饲料总质量的0.2%,自由采食90d)与甲减大鼠模型常规用量(15～30mg/kgi.p.,用药时间15d)(Gilbert&Paczkowski,2003;Gökseletal.,2006)相比显著过高。适量摄取PTU抑制甲状腺功能,可以导致肝脏甘油三酯脂肪酶(HTGL)活性降低,清除TG能力降低。但是过量摄取PTU会对大鼠机体造成更大的损伤,如心肌功能受损、肝肾功能受损、摄食量减少、体质量减轻、精神抑郁等。相对正常组,模型组动物在实验后期摄食量骤减、体质量减轻,可能是直接导致TG水平降低的主要原因。并且对血清中CK和CK-Mb进行检测,对心脏进行病理检测,也证实模型组心肌功能受到严重损伤,模型组部分大鼠出现心包积液,这与甲减型心脏病特征(张劼等,2005)相符。建立良好的动物模型应在尽量减少对机体其他器官的损害为前提下,造成靶器官的损伤及病变,最大程度接近人类自然发病状态。因此,PTU的最佳用量仍需要进一步研究。VEGF与AS的发生密切相关,因为发生AS损伤的动脉中膜内的滋养血管数目增加,同时粥样斑块内血管增生活跃,而VEGF是介导血管生成的重要因素,可强烈促使血管内皮细胞进行有丝分裂(李京佳等,2012)。并且VEGF特异地作用于血管内皮细胞,不仅能诱导血管新生,还能增加血管通透性,因而可以促进炎性细胞向动脉粥样硬化斑块内迁移、浸润,并分泌一些细胞因子,如肿瘤坏死因子(αtumornecrosisfactor,TNF-α)等,这些因子反过来又可促进斑块内血管的生成,高血脂症及AS病变过程均伴随VEGF表达的增加。观察实验末期各组动脉血管中VEGF免疫组化结果,模型组阳性表达较多(P<0.05),差异明显,VEGF表达在血管壁各层次,如平滑肌细胞、巨噬细胞等,而正常组主要表达在血管内皮;并且HFJ大鼠模型组较Wistar大鼠模型组阳性表达较多(P<0.05),差异明显。本实验通过血清生化指标、病理学及免疫