基于微卫星dna标记的zzcla长爪沙鼠群体遗传多样性分析

基于微卫星dna标记的zzcla长爪沙鼠群体遗传多样性分析

长爪沙鼠，也被称为沙田鼠，属于母乳喂养、牙齿科、老鼠科和沙鼠科。它主要分布在我国的主要分布地区内蒙古及周边地区的牧场上。这是一个开发和应用广泛的“多功能”实验动物。由于具有许多独特的生物学特征,长爪沙鼠已被广泛用于医学研究的各个领域。长爪沙鼠的脑血管不同于其他动物,有独特的解剖特征,脑底动脉环后交通枝缺损,没有连系颈内动脉系统和椎底动脉系统的后交通动脉,不能构成完整的Willis动脉环,利用此特征,结扎沙鼠的单、双侧颈动脉,很容易造成脑梗塞病变。长爪沙鼠具有类似人类自发性癫痫发作的特点,月龄不同,发作频率也不同,尤其是生后2月龄左右的沙鼠,对非特异性因子具有感受性,有的可因癫痫发作致死。加利福尼亚大学洛杉矶分校Loskota等在沙鼠具有癫痫发作特点的基础上,育成新的品系,培育出发作感受型WJL/UC和发作抵抗型STR/UC两个品系。长爪沙鼠接种幽门螺杆菌(Hp)后可致慢性胃炎、胃溃疡、胃癌、MALT淋巴瘤,寿命较小鼠长,可以建立Hp长期感染动物模型,其胃黏膜发生的病理改变与人类Hp感染发生的胃黏膜改变类似。近期Ohkusa等还发现Hp感染可致蒙古沙鼠十二指肠炎和十二指肠浅表溃疡。沙鼠是目前较为理想的Hp感染动物模型。尽管长爪沙鼠的形态学、解剖学、生理学和繁殖方法及生物学特性等已进行了广泛研究,但其遗传背景的研究还不够深入,分子标记技术在这方面研究中具有独特的优点。微卫星DNA又称短串联重复或简单重复序列,其基本构成单位为2～6bp,多位于编码区附近,也可位于基因内的间隔区、外显子、内含子和调控区域,且分布均匀,是一类用途十分广泛的DNA分子标记。用微卫星作为长爪沙鼠的遗传标记,采用PCR技术检测长爪沙鼠遗传多态性,开展长爪沙鼠遗传领域的研究,可以为长爪沙鼠资源的保护和开发利用奠定理论基础。Neumann等用克隆方法筛选了9个微卫星位点并对欧美的野生及实验长爪沙鼠群体进行了研究。赵太云等从长爪沙鼠近缘物种大、小鼠的微卫星位点中筛选出8个长爪沙鼠微卫星位点。Z:ZCLA长爪沙鼠是浙江省实验动物中心驯养的啮齿类实验动物封闭群,已保种达40余代,为国内维持时间最长、特性稳定、应用单位最多、使用量最大以及基本生物学特性研究较系统的第一个远交封闭群实验动物。Z:ZCLA长爪沙鼠是研究EHFV特性和研制流行性出血热疫苗的首选实验动物。最近又用Z:ZCLA长爪沙鼠研制出双价苗,供应社会;卫生部上海生物制品研究所生产出血热疫苗所用长爪沙鼠原种亦来源于Z:ZCLA长爪沙鼠封闭群。但是随着遗传代数的增加,导致基因杂合度减小,出现基因丢失等现象,因此有必要对其进行遗传检测,确定其遗传多样性水平,为群体遗传保种方案的提出提供理论依据。微卫星DNA的遗传学稳定性已作为衡量人类和动物基因组整体稳定性的良好指标。研究发现,在近交系动物中,个体间遗传差异小,而不同近交系之间由于近交而固定的基因不同,因此遗传差异较大,不同品系间的微卫星DNA具有明显多态性,而同一品系的不同个体不具有多态性。微卫星在小鼠等近交系动物的遗传检测中已得到广泛的应用,但在长爪沙鼠近交系中的研究国内外还未见报道。本研究以Z:ZCLA封闭群、野生群和近交系长爪沙鼠为研究对象,筛选长爪沙鼠微卫星标记,并应用获得的微卫星标记分析3个群体的遗传结构和整体遗传概貌,检测群体的基因杂合度和多态信息含量。通过对比Z:ZCLA封闭群和野生群,判定Z:ZCLA长爪沙鼠封闭群的遗传多样性水平,监测其由于长期封闭可能存在的基因丢失过多和遗传多样性水平降低等问题,为实现Z:ZCLA封闭群的可持续发展和全面实验动物化提供理论依据。同时,通过监测由日本国家实验动物中心(NIBIO)培育而成的3个长爪沙鼠近交系,分析这3个近交系品系内的纯度,检测其是否符合近交系的要求,通过检测这3个近交系品系间的多态性,以期获得各个品系的特异性位点和遗传背景标记,为国内长爪沙鼠近交系的培育提供参考。1材料和方法1.1材料表面1.1.1长规定株沙鼠Z:ZCLA封闭群长爪沙鼠:浙江省实验动物中心驯养的封闭群,共采集20只,雌雄各半;野生长爪沙鼠:由陕西省疾病预防控制中心提供,采自陕西省定边县野外,共20只,雌雄各半;近交系沙鼠:3个品系是日本国家实验动物中心(NIBIO)培育而成,其中两种为毛色有差异的品系:MGW(白毛品系)和MGB;MGR毛色为棕色,是抗癫痫的品系。1.1.2长利益限制在长7d近缘种子上的合成本次所用的17对引物参考Neumann等用克隆方法获得的9对长爪沙鼠引物(AF200939、AF200940、AF200941、AF200942、AF200943、AF200944、AF200945、AF200946和AF2009417)和赵太云等从长爪沙鼠近缘物种大、小鼠的微卫星位点中筛选出8个长爪沙鼠微卫星位点(D2Mit30、D6Mit102、D10Mit180、D11Mit128、ACPH、APOC3、PKC和SCN),由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。1.2方法1.2.1k-n-meq-l-4-1e-3-羟基苯基-1,3,4-二氢-3,5-四甲基-3,5-四氢-1,4-四氢-3,5-吡啶二唑3-甲基称取长爪沙鼠肝脏0.1g,搅碎后加DNA提取液至1mL,再加10µL蛋白酶K,经酚-氯仿抽提,GeneCleanKitⅡ(Bio101)进行纯化,晾干,加200µL双蒸水溶解,用UV2000(Amershampharmacia)紫外分光光度计检测纯度与浓度,调至100ng/µL,4℃保存备用。1.2.2pcr扩增及电泳50µL反应体系:100ng/µLDNA模板1.0µL,10×buffer5µL,25mmol/LMgCl23.0～7.0µL,20mmol/LdNTP4µL,1pmol/µL两侧引物各1µL,5U/µLTaq酶0.5µL,用双蒸水补足50µL。PCR扩增条件:94℃预变性5min,然后进行如下35个循环:94℃变性1min,复性1min,温度因位点而异(50～56℃)(表1),72℃延伸2min,最后72℃延伸10min。循环结束后72℃再延伸10min。PCR扩增产物经10%变性聚丙烯酰胺凝胶、200V电泳2h,拍照。根据不同基因片段电泳迁移率的不同,利用Kodak成像软件KDSZD2.0计算其片段长度。50bpDNAladder购于上海生工生物工程技术服务有限公司。1.3统计方法1.3.1基因频率利用Microsatellite-Toolkit软件计算等位基因频率、观察杂合度和期望杂合度。根据Botstein等的公式计算每一个群体每一个位点的多态信息含量。n为等位基因数,pi为第i个等位基因的基因频率,pj为第j个等位基因的基因频率。1.3.2f-statistis的显著性根据FSTAT程序计算F-statistics固定指数,由Benferroni程序计算F-statistics的显著性。品种间的FST值则通过GENEPOP程序算得。群体间的Reynolods’遗传距离则由FST值算得,DR=-ln(1-FST)。1.3.3基因流动nm群体间每代繁殖成功的迁移数,由FST=1/(4Nm+1)算得。1.3.3基因型分布的稳定性d=(Ho-He)/He一般d值越接近于零,说明基因型分布越接近于平衡状态;d值越偏离零,基因型分布越偏离平衡状态。d值为正说明杂合子过剩,d值为负说明杂合子缺失。2结果与分析2.1引物序列、复性温度和mg2+浓度本研究所选用的17个微卫星位点在Z:ZCLA封闭群和野生群中共有9个获得稳定的扩增产物,分别为AF200940、AF200941、AF200942、AF200945、AF200946、AF200947、D11Mit128、PKC和SCN,各个位点的引物序列、复性温度和Mg2+浓度见表1。在3个日本近交系中共有8个位点获得稳定的扩增产物,分别为AF200941、AF200942、AF200945、AF200946、AF200947、D11Mit128、PKC和SCN,复性温度和Mg2+浓度见表1。2.2遗传分化和杂合型Z:ZCLA封闭群和野生长爪沙鼠群体中共检测到41个等位基因,等位基因大小、期望杂合度、观测杂合度和平均多态信息含量见表2,部分电泳图谱见图1。单个位点的等位基因数从1～7个不等,平均为4.56。对于整个群体而言,D11Mit128和PKC位点的期望杂合度(He)和多态信息含量(PIC)值最低,为0;而AF200945则拥有最高的期望杂合度和PIC值,为0.770和0.718。两个长爪沙鼠群体的平均期望杂合度见表3,两个群体的期望杂合度分别为:封闭群0.3704;野生群略高,为0.3893。通过每个位点的固定指数FIT、FIS、FST检验群体的遗传分化。两个长爪沙鼠群体各个位点的F-statistics分析结果见表4。对于整个群体而言,平均分化系数为39.8%,群体内杂合子过剩显著。通过计算,两个长爪沙鼠群体的Reynolds’遗传距离为0.5075,Nm值为0.3781。两个群体的遗传偏离指数:Z:ZCLA封闭群d值为-0.0003;野生群为0.3598,见表3。结果显示Z:ZCLA封闭群的基因型分布接近于平衡状态,d值为负说明略微表现有为杂合子缺失现象;野生群的检测结果显示基因型分布偏离了Hardy-Weinberg平衡状态,且表现为杂合子过剩。2.3pcr扩增结果在3个近交系中共有8个位点(AF200941、AF200945、D11Mit128、PKC、SCN、AF200942、AF200946和AF200947)获得稳定的扩增结果,共检测到11个等位基因,片段大小在140～243bp之间。获得稳定扩增结果的8个微卫星引物对3个品系内个体间的扩增结果均显单态性,其中5个位点为纯合,3个位点为杂合,品系内的个体均显示了较好的一致性。3个品系间个体的扩增结果均显单态性,这3个近交系品系间未显示出多态性,未能获得各个品系的特异性位点和遗传背景标记。结果见表5,部分电泳图谱见图2。3讨论3.1遗传多样性分析微卫星标记技术已广泛应用于动植物的遗传多样性分析,包文斌等将微卫星标记用于中国红原鸡和泰国红原鸡的遗传多样性分析,为中国家鸡具有独立的起源提供了一定的佐证;贾斌等用微卫星标记对新疆8个绵羊品种作了遗传多样性分析;段世华等用微卫星DNA标记对我国杂交水稻主要恢复系遗传差异作了检测分析,但在长爪沙鼠遗传多样性分析中的应用还较少。在微卫星标记技术中杂合度和多态信息含量是估测群体遗传变异度的重要指标。作为遗传多样性度量的最常用杂合度指的是期望杂合度,即从一个基因库中随机抽出的一个位点的两个拷贝为不同等位基因的概率。此杂合度值越大,群体内的遗传变异越大。Ott将多态位点定义为杂合度为0.10的位点,本研究所分析的9个微卫星标记中,Z:ZCLA封闭群的期望杂合度为0.3704,野生群较封闭群高为0.3893,均显示出较丰富的遗传多样性和较高的选择潜力。多态信息含量(PIC)是衡量标记多态性较好的指标。Bostein等提出衡量基因变异程度高低的多态信息量指标,PIC>0.5时为高度多态,0.25<PIC<0.5时为中度多态,PIC<0.25时为低度多态。本研究中所检测的长爪沙鼠9个微卫星标记的平均多态信息含量分别为:Z:ZCLA封闭群0.3256;野生群为0.3344。表明两个群体遗传多样性水平均处于中度多态,且野生群要高于Z:ZCLA封闭群。有效等位基因数也是反映群体遗传变异的一个指标,尤其在保护遗传学中,有时更强调等位基因数目对种群的影响,但有效基因数目容易受到样本量的影响。本研究的9个微卫星位点中,平均等位基因数为4.56,这说明本研究的样本量较为充分所选择的微卫星引物在两个长爪沙鼠群体中所提供的多态信息含量较为丰富,用其分析遗传多样性具有较高的有效性和可靠性。在所分析的结果中,相对于野生长爪沙鼠群体来说,Z:ZCLA封闭群的平均期望杂合度和多态信息含量以及有效等位基因数都较野生群低,这可能是由于Z:ZCLA封闭群种群数量较小,且保种时间长导致近交系数有所上升等原因造成的。对于封闭群实验动物,遗传多样性一般是指品种或品系内个体在DNA水平上的差异,遗传多样性减少,许多有重要价值的基因可能已经丢失,种质质量和育种潜力就会降低,所以必须采取科学有效的措施来保护这个品种,防止优良基因的丢失。两个群体的遗传分化系数为39.8%,表明两个群体间的分化程度较大,而且呈杂合子过剩现象。通过计算,两个长爪沙鼠群体的Reynolds’遗传距离为0.5075,Nm值为0.3781,这两个群体并没有表现出较近的遗传距离,且彼此之间的基因流动较小,这可能是因为Z:ZCLA封闭群的初始群体和本研究所采集的野生沙鼠地域有差别,且经过40多代保种封闭之后由于群体内部分位点近交导致基因丢失等原因。本研究中通过对比发现野生群中存在一些Z:ZCLA封闭群中没有的基因片段,以此为参考可适当引入野生长爪沙鼠以使Z:ZCLA获得更多的优良基因,提高Z:ZCLA封闭群的遗传多样性水平,利于其遗传育种。本研究通过对长爪沙鼠种群结构的分析,建立检测遗传多样性的方法,为Z:ZCLA长爪沙鼠封闭群的保种研究提供