第三章 细胞生物学研究方法(4学时)

第三章细胞生物学研究方法

细胞生物学研究方法进行初步观察形成可验证的假说设计试验收集资料解释结果作出合理结论查阅已有知识生物学研究模式生物是基于不同物种享有共同分子机制CaenorhabditiselegansDrosophilamelanogasterArabidopsisthaliana第三章细胞生物学研究方法第一节细胞形态结构的观察方法第二节细胞组分的分析方法第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术第一节细胞形态结构的观察方法

1光学显微镜技术（lightmicroscopy）

2

电子显微镜技术

(Electromicroscopy)3扫描遂道显微镜

(scanningtunnelingmicroscope)一、光学显微镜技术（lightmicroscopy)

普通复式光学显微镜技术

荧光显微镜技术（FluorescenceMicroscopy）

激光共焦扫描显微镜技术（LaserScanningConfocalMicroscopy）

相差显微镜（phase-contrastmicroscope）（自习）普通复式光学显微镜技术

分辨率是指区分开两个质点间的最小距离普通光学显微镜各种显微镜的分辨率梯度荧光显微镜技术

（FluorescenceMicroscopy）原理荧光显微镜技术

（FluorescenceMicroscopy）

应用

直接荧光标记技术

间接荧光标记技术(免疫荧光标记技术)

用于特异蛋白质等生物大分子的定性定位：如绿色荧光蛋白(GFP)的应用

应用：绿色荧光蛋白激光共焦扫描显微镜技术

（LaserScanningConfocalMicroscopy）

原理：

应用： 排除焦平面以外光的干扰，增强 图像反差和提高分辨率(1.4—1.7倍)，通过“光切片”观察样品内部结构，可重构样品的三维结构。激光共焦扫描显微系统(Confocal

System)PineTreepollen-collectedonaBio-RadMRC1024atPurdueUniversityCytometryLaboratories

利用光切片技术显示的花粉内部结构1为转GFP基因的烟草单细胞；2为转SCaM1-GFP融合基因的烟草单细胞；3为转SCaM4-GFP融合基因的烟草单细胞。

质壁分离后转基因烟草单细胞的激光共聚焦显微镜观察细胞壁细胞膜细胞核细胞壁细胞壁细胞膜细胞核细胞膜细胞核细胞核细胞膜细胞壁细胞核细胞膜二、电子显微镜技术

电子显微镜的基本知识

电镜与光镜的比较

电子显微镜的基本构造

电镜与光镜的比较

显微镜分辨本领光源透镜真空成像原理LMEM200nm100nm0.1nm可见光（400-700）紫外光（约200nm)电子束（0.01-0.9）玻璃透镜玻璃透镜电磁透镜不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差电子显微镜的基本构造电子束照明系统、成像系统、真空系统、记录系统二、电子显微镜技术

电子显微镜的基本知识

电镜与光镜的比较

电子显微镜的基本构造

主要电镜制样技术

负染色技术

冰冻蚀刻技术

超薄切片技术

电镜三维重构技术

主要电镜制样技术超薄切片技术用于电镜观察的样本制备示意图细胞超微结构

负染色技术（Negativestaining）

染色背景，衬托出样品的精细结构，如病毒、核糖体等结构。

冷冻蚀刻技术（Freezeetching）

冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。

电镜三维重构技术

电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学（StructuralBiology）

主要研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段。

固定

包埋

切片

染色超薄切片技术超薄切片技术图片示例冷冻蚀刻二、电子显微镜技术

电子显微镜的基本知识

电镜与光镜的比较

电镜与光镜光路图比较

电子显微镜的基本构造

主要电镜制样技术

负染色技术

冰冻蚀刻技术

超薄切片技术

电镜三维重构技术

扫描电镜（Scanningelectronmicroscope，SEM）

扫描电镜

原理与应用：

电子“探针”扫描，激发样品表面放出二次电子，探测器收集二次电子成象。

CO2临界点干燥法防止引起样品变形的表面张力问题三、扫描遂道显微镜

ScanningTunnelingMicroscope,STM80年代发展起来的检测样品微观结构的仪器。反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等。

特点：分辨率高：

侧分辨率：分辨率为0.1～0.2nm，纵分辨率可达0.001nm

不受介质限制

非破坏性

用途：纳米生物学研究领域中的重要工具,在原子水平上揭示样本表面的结构，观察生物大分子、膜、病毒等的结构。

2.特异蛋白抗原的定位与定性

3.细胞内特异核酸的定位与定性

4.放射自显影技术

1.离心分离技术第二节细胞组分的分析方法一、离心分离技术

用途：分离细胞器与生物大分子及其复合物

差速离心：分离密度不同的细胞组分

密度梯度离心：精细组分或生物大分子的分离差速离心密度梯度离心常用的介质：蔗糖、氯化铯、甘油等。二、特异蛋白抗原的定位与定性

免疫荧光技术

快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限

免疫电镜技术

免疫胶体金技术应用：能对蛋白进行精细定位。如通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等。

蛋白电泳(SDS)与免疫印迹反应(Western-Blot)免疫荧光技术图片示例免疫胶体金技术原理与图片示例三、细胞内特异核酸的定位与定性

光镜水平的原位杂交技术

（同位素标记或荧光素标记的探针）

电镜水平的原位杂交技术

（生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合）

四、放射自显影技术

原理及应用：

利用同位素的放射自显影，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究；

实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。

第三节细胞培养、细胞工程

1细胞的培养2细胞工程与显微操作技术一、细胞的培养

动物细胞培养

类型：原代培养细胞（primaryculturecell） 传代培养细胞（s