原位核酸杂交课件

原发性硬化性胆管炎FISH胆管癌细胞刷检顺序单分子荧光原位杂交

（seqFISH）本月《Nature》报道美国华裔蔡龙团队开发用于研究单细胞中哪些基因是活跃的：一个细胞中超过200个基因的表达水平体内分析：追踪第八章

核酸分子生物学基础第二节DNA的变性与复性迟菁华一、DNA变性

(DNAdenaturation)

定义：双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成单链无规则线团，因而发生性质改变→不涉及一级结构的改变性质改变：粘度下降：单股结构柔软而松散→沉降速度增加，浮力上升

紫外吸收增加：增色效应旋光性改变：对称性及局部的构形改变DNA变性影响因素：①加热；②改变pH；③有机溶剂：醇、尿素、酰胺等

增色效应(hyperchromiceffect)：紫外吸收作用增强→260nm波长→碱基外露

溶解曲线：以温度对紫外吸光率作图，得到DNA变性曲线。当温度升高到一定范围时，DNA溶液在260nm处的吸光度突然明显上升至最高值，随后即使温度继续升高，其吸光度也无明显变化→DNA变性是在一个很窄的温度范围内发生的。DNA变性融解温度(meltingtemperature,Tm)：50%DNA分子发生变性的温度，这一现象和结晶的融解相类似。影响Tm的因素：pH：极端pH值离子强度：离子强度上升，Tm值随之增大碱基比例：Tm值由G-C碱基配对的含量决定分子长度：核酸分子越长，Tm值越大变性剂：降低Tm值

二、DNA复性

(DNArenaturation)定义：变性DNA只要消除变性条件，二条互补链可以重新结合，恢复原来的双螺旋结构退火：DNA热变性后，将温度缓慢冷却，维持在比Tm低25-30℃左右时，变性后的单链DNA即可恢复双螺旋结构复性后的DNA，理化性质都能得到恢复。影响复性速度的因素温度和时间：变性DNA溶液在比Tm低25℃的温度下维持一段长时间,其吸光率会逐渐降低。比Tm低25℃左右的温度是复性的最佳条件。温度过高，有利于DNA变性而不利于复性；在很低的温度下,不利于双键间随机形成的错配氢键的断裂。复性时温度下降必须是一缓慢过程。降温时间太短以及温差大均不利于复性。

影响复性速度的因素DNA顺序的复杂性：顺序简单的DNA分子，复性很快。顺序复杂的DNA,复性较慢。DNA片段的大小：大分子DNA扩散速度较慢，复性较慢。DNA浓度：DNA浓度愈高，复性速度愈快离子强度：较高时，复性速度较快。复性的程度DNA浓度：较高时，有利于复性信息含量的多少：病毒DNA比动物DNA容易复性第九章原位核酸分子杂交技术定义：简称原位杂交(insituhybridization)，是应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合而形成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系统，通过组织化学或免疫组织化学方法在被检测的核酸原位形成带颜色的杂交信号，在显微镜或电子显微镜下进行细胞内定位。①探针合成；②原位杂交：互补的碱基序列；③显色；④定位意义：可在原位研究细胞合成的某种蛋白质或多肽的基因表达→从分子水平研究细胞内基因表达及有关基因调控第一节原位核酸分子杂交技术的发展分子生物学、组织化学及细胞学相结合创立：1969年美国耶鲁大学Gall和Pardue首先用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交发展：同位素标记探针：细胞、组织以及病毒DNA非放射性标记探针：①荧光素；②DNP（2,4-二硝基苯甲醛）+抗DNP酶标抗体+过氧化物酶底物；③生物素-抗生物素；④地高辛：可以检测蛋白和基因双重表达原位核酸分子杂交技术的发展核酸探针分类：标记方法：放射性、非放射性性质：DNA（单链、双链）、RNA、cDNA、cRNA、寡核苷酸原位杂交分类：DNA-DNA，cDNA-RNA、RNA-RNA、寡核苷酸-DNA或RNA技术基础：分子生物学→分子克隆、质粒和噬菌体第二节原位分子杂交技术的基本方法原位杂交的基本方法：杂交前难备：取材、固定、玻片的处理，如何增强核酸探针的穿透性、减低背景染色等杂交杂交后处理显示：放射自显影和非放射性标记的组织化学或免疫组织化学显色一、取材、固定尽快固定的目的：保持细胞结构最大限度地保存细胞内DNA或RNA的水平减少RNA的降解：迅速固定或液氮冷冻定位：DNA：稳定RNA：固定剂的种类、浓度和固定的时间十分重要取材、固定固定剂：4%多聚甲醛：最常用，不会影响探针穿透入细胞或组织醋酸-酒精混合液和Bouin液：增加探针的穿透性，RNA↓，组织收缩mRNA的定位：①多聚甲醛1-2h→15%蔗糖4℃冰箱过夜→冰冻切片；②液氮冷冻→切片→多聚甲醛10min→-70℃；③冷冻切片→多聚甲醛蒸汽石蜡包埋标本：杂交信号低二、玻片和组织切片的处理1.玻片的处理：盖玻片和载玻片去除RNA酶：热肥皂水→自来水→清洁液24h→95%酒精浸泡24h→蒸馏水冲洗→烘干过夜：150℃或以上

硅化：盖玻片和载玻片，浸于DMDC（二甲二氯硅烷），用锡箔纸包裹。硅化玻片不产生气泡。盖玻片自身有一定的重量→

均匀覆盖和防止蒸发；载玻片可防止脱片现象。粘附剂：常用多聚赖氨酸液和氨丙基三乙氧基硅烷(APES)丙酮液→垂直烤片→易出现气泡2.增强组织的通透性和核酸探针的穿透性方法：TritonX-100：聚二乙醇辛基苯基醚，去污剂；增加探针对细胞膜的通透性消化酶：蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶等→用量和时间蛋白酶K的消化作用浓度及孵育时间：视组织种类、固定剂种类、切片的厚薄而定应用：100µg/ml37℃孵育15-20min；加入EDTA终止：甘氨酸再固定：多聚甲醛

3.减低背景染色杂交前：用稀盐酸

(0.2mol/L)处理10分钟，再结合蛋白酶消化，可避免碱性蛋白与核酸之间的非特异性结合。乙酸酐和三乙醇胺预杂交：用不含探针和硫酸葡聚糖的预杂交液预先孵育标本，以阻断非特异性位点杂交后：用低浓度的RNA酶溶液洗涤，以减少残留的RNA4.防止RNA酶的污染只需要少量RNA酶的存在就会引起RNA的降解。整个杂交前处理过程都需带消毒手套：手汗、唾液、灰尘→一次性口罩、帽子、手套所有玻璃器皿及镊子都应于实验前置高温（240℃）烘烤：温度必须在150℃以上。其他：石蜡标本切片时还需75%酒精擦洗工作台和切片刀；展片需用高压消毒过的蒸馏水/超纯水；设置RNA实验专用实验室，所有器械应为专用三、杂交(hybridization)将探针与靶核酸结合形成杂交体→“短兵相接”、最关键双链→变性处理加盖玻片：将杂交液滴于切片组织上，加盖硅化的盖玻片，或采用无菌的蜡膜代替硅化的盖玻片，防止杂交液的蒸发；周围加液体石蜡/橡皮泥封固。湿盒孵育：盛有少量5×SSC或2×SSC溶液；最佳杂交温度多数为37℃-42℃

四、杂交后处理漂洗目的：除去过剩探针，解除非特异性结合→

非严格碱基配对的杂交体盐溶液：一系列不同浓度、不同温度。原则是盐浓度由高到低，而温度由低到高。洗涤过程中至少有一次高严格度条件(低盐、高温、高甲酰胺)下的漂洗。杂交后处理RNA酶液：RNA-RNA杂交体不受影响。试剂不能含有对RNA酶有抑制作用的物质，如还原剂和甲酚胺等。注意：勿使切片干燥五、显示杂交体检测系统，因探针标记物而异放射性核素标记探针的检测：放射自显影非放射性标记探针的检测：荧光素标记探针：荧光显微镜辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记探针：酶促反应，同免疫组化染色半定量测定：严格控制实验的同一条件六、对照实验和结果的判断对照实验的设置应根据核酸探针和靶核酸的种类以及现有的条件选定→3～4种探针对照：（1）吸收实验：将标记探针先同互补的DNA或RNA预杂交→阴性探针对照（2）已知阳性或阴性组织对照：在已知含靶核酸序列的阳性组织和不含靶核酸序列的阴性组织标本上进行杂交。阳性组织出现阴性→对探针的制备及各个步骤进行检查；阴性组织出现阳性→非特异性信号（3）用同义RNA探针进行杂交：检测mRNA时常用反义RNA探针。同义RNA探针→阴性杂交反应对照（1）空白实验：将杂交液中除去核酸探针→阴性（2）将切片用核酸酶预处理：DNA酶或RNA酶→杂交信号明显减弱。以核酸酶预处理标本并不能使杂交信号完全消失。在酶处理后，需把酶清除干净，以免残留的酶破坏探针而导致错误结论。组织对照（1）Southern或Northern印迹反应：提取DNA或总RNA→

结果与原位杂交一致。阳性细胞比例很小时，原位杂交可能为阳性，而印迹反应呈阴性。（2）免疫组织化学：证明蛋白质和相应的mRNA共存于同一细胞中检测系统对照（1）放射自显影检测系统对照：阳性对照是将浸渍乳胶的空白片在光线下曝光后显影。阴性对照是将空白片浸乳胶后不经曝光便与杂交标本一起进行显影。如果阴性对照片上有较多银粒，应换用新乳胶。（2）非放射性原位杂交检测系统对照：免疫组织化学的一系列阳性和阴性对照第三节原位分子杂交方法

原位杂交分为DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交三类DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交较多见一、原位DNA和DNA分子杂交DNA-DNA杂交：在双链DNA经热变性成为单链状态以后，放在适当的盐浓度和温度的条件下，二条单链的DNA又会恢复成原来的双链结构。不同种类的DNA不能形成双链结构→可分析不同生物品种来源的两条或多条DNA链间彼此关系密切程度→染色体原位杂交及对染色体中的DNA进行定位DNA探针：①多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。②多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖；不易降解。③标记方法：缺口平移法，随机引物法，同位素和非同位素标记。④缺点：易自身粘连，双链探针使用前需变性处理。

切口平移法是实验室最常用的一种脱氧核糖核酸探针标记法。利用E.coliDNA多聚酶I的多种酶促活性将标记的dNTP掺入到新合成的DNA链中从而形成高比活性的均匀标记的DNA探针。探针标记物20多种放射性标记物：32P、3H、35S、14C、125I等，敏感性高，但存在辐射危害，有半衰期限制，检测时间长，成本高，因此应用受到了限制。非放射性标记物酶类：HRP和AKP等半抗原：地高辛及生物素等荧光素：异硫氰酸荧光素(FITC)等

敏感性不如放射性标记探针，但其稳定性和分辨率高，检测时间短，且操作简便，成本低，不存在安全问题，因此应用日趋广泛。（一）地高辛(Digoxigenin,Dig)标记的DNA探针检测石蜡切片病毒DNADig：又称异羟基洋地黄毒甙配基，是类固醇半抗原，其抗体与任何固醇类似物无交叉反应。Dig标记的探针：+原位核酸分子，+与酶或荧光素偶联的地高辛抗体→特别是在检测内源性生物素高的肠道系统时采用免疫酶学检测方法Dig–HRP检测体系：以DAB/H2O2为底物，结果为棕色；价廉、稳定。Dig–AKP检测体系：以BCIP/NBT为底物，结果为蓝紫色；灵敏度和分辨率高。1.组织切片的预处理（1）固定：10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，切片厚5μm，粘附于涂有粘附剂的硅化玻片上，60℃烤片6-8h（2）脱蜡：二甲苯10min×2，梯度酒精入水，PBS5min×2（3）除蛋白：0.2mol/LHCl37℃20-30min，PBS5min×2（4）抑制核酸酶：50℃2×SSC30min(柠檬酸钠),含5mmol/LEDTA(乙二胺四乙酸)组织切片的预处理（5）蛋白消化：100μg/ml蛋白酶K37℃20-25min（6）中止蛋白酶反应：0.2%甘氨酸的PBS液中5min×2（7）再固定：4%多聚甲醛10-20min，PBS5min×2（8）脱水：梯度酒精，晾干地高辛标记的DNA探针检测石蜡切片病毒DNA2.预杂交：加预杂交液20μl/张切片，42℃30min3.杂交：加适量杂交液，盖硅化盖片，95℃10min，使探针及病毒DNA变性；置于冰上1min，2×SSC湿盒内，37-42℃过夜

(可采用原位杂交仪进行变性和杂交)

4.杂交后漂洗（1）2×SSC液内振动移除盖片，5-10min×2，0.5×SSC5-10min×2（2）加封阻缓冲液II

：37℃或室温30min，缓冲液I15min（3）AKP标记的Dig抗体：37℃30min，缓冲液I15min×2（4）AKP底物缓冲液III：2-5min地高辛标记的DNA探针检测石蜡切片病毒DNA5.显色：（1）显色液配制：缓冲液III加NBT和BCIP，37℃暗处显色（2）终止反应：缓冲液IV10min（3）核固红复染5min，干燥脱水，DPX封片6.结果：阳性呈紫蓝色，阴性→胞核呈红色二、RNA原位核酸杂交RNA原位杂交组织化学或RNA原位杂交（一）基本原理：RNA原位杂交：运用标记的cRNA或寡核苷酸等探针检测细胞和组织内RNA表达的一种原位杂交技术基本原理基本原理：用标记的已知核苷酸片段，按碱基配对原则，与待测细胞或组织中相应的RNA片段结合，所形成的杂交体经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的mRNA、rRNA或tRNA分子应用：已远超出DNA原位杂交，为最有效的分子病理学技术，特别适合分析低丰度和罕见mRNA的表达RNA与DNA原位杂交的主要区别点①使用的探针不同：RNA→RNA或寡核苷酸探针，可避免双链DNA探针杂交中的复性和第二条链的竞争性杂交②杂交体不同：cRNA-RNA比DNA-DNA、cDNA-RNA性能稳定，特异性更强③检测的目的不同：RNA→内源性和外源性基因，内源性基因包括细胞内固有、异常和变异基因。DNA→外源性基因，以获得病原学诊断④灵敏度不同：RNA比DNA原位杂交能获得更好的低拷贝核苷酸的定位（二）RNA原位杂交中的探针探针的种类：RNA探针：带有标记的能与组织内相对应的RNA核苷酸序列互补结合的一段单链cDNA或cRNA分子（1）单链cDNA探针：cDNA：是由RNA经逆转录酶催化产生的，该酶以RNA为模板，根据碱基配对原则，按照RNA的核苷酸顺序合成DNA。克隆时，可选择不同的载体来控制cDNA是双链还是单链。质粒→双链；M13衍生载体→单链优点不存在内含子不存在高度重复序列不需要变性克服了双链DNA探针两条链之间复性的缺点可提高探针浓度不形成大的链状连环使探针难于渗入细胞内较为理想（2）cRNA探针是以cDNA为模板在体外转录而成的探针，可通过克隆于质粒载体产生改变cDNA插入方向或选用不同的RNA聚合酶→同义或反义RNA探针→cRNA探针经过体外转录能得到标记的cRNA探针→长度比较一致cRNA探针优点：可避免应用双链cDNA探针时存在的两条链之间的复性cRNA和mRNA的杂交体要比cDNA-mRNA杂交体稳定，不受RNA酶的影响杂交饱和水平比双链DNA探针高8倍缺点：制备复杂需要较好的设备易被RNA酶破坏（3）寡核苷酸探针指以核苷酸为原料，在体外人工合成的单链DNA片段均由DNA合成仪合成优点避免高度重复序列的不利影响制备简易：不需要复杂的实验条件，不需要纯化组织穿透性好：不长，单链特异性较强：可按照目的基因合成特异性核苷酸探针杂交时间短使用简便：对RNA酶不敏感；不需预先加热解链缺点长度必须适宜：太长可造成内部错误杂交；太短可形成非特异性结合与mRNA的杂交不如RNA-RNA杂交稳定敏感性较低：只能用末端标记法标记，结合的标记物较少设计靶DNA或mRNA的序列已知→容易确定；仅知道氨基酸序列→选择密码简并性最小的氨基酸序列原则：长度一般为30～50碱基(G＋C)含量应在40～60％分子内不应存在互补区2.探针的标记①酶反应法；②化学反应法（1）末端标记法：是将标记物导入线型DNA或RNA的5，末端或3，末端的一类标记法，主要用于寡核苷酸探针或短的DNA或RNA探针的标记（2）体外转录法转录组分包括：纯化的噬菌体RNA聚合酶、含噬菌体RNA聚合酶启动子的DNA模板、标记的三磷酸核苷酸噬菌体内的转录仅需一个“最小”的机构非线型模板→

限制性内切酶线化模板通过RNA聚合酶SP6、T7或T3，将地高辛标记于RNA探针上。地高辛与UTP之间的键合对碱不敏感→

碱处理探针标记法直接标记法：探针与组织细胞内靶核酸所形成的杂交体可直接显示，对低拷贝的靶序列检测不理想间接标记法：用半抗原标记探针，通过免疫组织化学或亲和组织化学反应对半抗原定位，间接显示杂交体→最常用直接法原位杂交示意图间接法原位杂交示意图3.探针的纯化探针标记反应液中存在游离的dNTP或磷酸盐分子等→方法：乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA，而dNTP等小分子物质和蛋白质分子则留在上清液中→操作简便探针的纯化酚/氯仿抽提法：交替使用酚和氯仿。酚使蛋白质变性；氯仿能使液体分层，不但能使蛋白质变性，还能去除色素和蔗糖。可以一次抽提多量DNA。但是步骤相对繁杂，时间长，效率低，酚和氯仿具有挥发毒性纯化试剂盒：不含有机溶剂和剧毒药品，也不需特殊实验条件，时间短，提取的DNA的纯度和效率较高，但一次抽提DNA的量相对较少

4.杂交前准备防止RNA酶的污染（1）载玻片和盖玻片的处理：铝箔纸包裹，180℃烘烤4-6h戴一次性手套及口罩（2）新鲜标本的储存和冰冻切片的制备：容器、刀具等经高压消毒或0.1%

DEPC（焦炭酸二乙酯）水清洗标本投入4%多聚甲醛溶液内4℃2-4h，15%、30%蔗糖PBS溶液内4℃过夜标本或切片储存于超低温冰箱内（3）标本的固定和石蜡切片的制备沉淀固定剂：醇和酮类，组织通透性较好，但固定时间过长可引起RNA降解，易引起组织形态改变交联固定剂：醛类，能较好的保存RNA和组织形态结构，但固定时间过长，可形成交联，阻碍杂交体形成

5.杂交前探针的选择应与靶序列以外的核酸序列无同源性（1）RNA探针：50-150碱基；500碱基→约20h；超过500碱基→

碱基水解法；模板的长度尽可能接近探针长度（2）探针的浓度：①应超过靶序列的浓度，最佳浓度是达到靶核酸最大饱和度的最低浓度；②放射性标记探针浓度为0.5ng/μl，而非放射性标记为1.0ng/μl；③杂交液的量每张切片30-50μl；④保持杂交液不流失→玻片的清洁必须彻底，应用杂交罩等6.杂交的温度和时间可增加甲酰胺浓度来降低Tm黑暗中杂交孵育过夜（三）RNA原位杂交的其他注意事项cRNA探针检测组织切片中的RNA：①同一容器中不能同时放入含不同探针的切片②背景较深，可在52℃用含5%甲酰胺的2×SSC洗脱③显色液中加入左旋咪唑，可减少内源性碱性磷酸酶活性④碱性磷酸酶染色后不能经过酒精和二甲苯2.用寡核苷酸探针检测组织切片中的RNA①杂交温度比Tm低5-10℃。短于18个核苷酸时，杂交温度=2×(A+T)+4×(G+C)-5；大于36碱基，37-42℃②杂交后必须尽快漂洗③杂交液中加入变性剪切的鲑鱼精子DNA，用前须在沸水浴中10min；还加有大分子化合物，如小牛血清白蛋白，聚乙烯吡咯烷酮和硫酸葡聚糖，也能封闭非特异的DNA结合位点第四节荧光原位杂交技术及其应用荧光原位杂交技术(florescenceinsituhybridization，FISH)：是一种利用荧光信号对原位杂交样本进行检测的技术。它将荧光信号的高灵敏度、安全性及直观性和原位杂交的高特异性结合起来，通过荧光标记的核酸探针与待测样本核酸进行原位杂交，在荧光显微镜下对荧光信号进行辨别和计数，从而对染色体或基因异常的细胞和组织样本进行检测和诊断，为各种基因相关疾病的分型、预前和预后提供准确的依据发展1986年，Dilla等首次用荧光素直接标记DNA探针检测人染色体Pinkel等用生物素标记DNA探针，建立了间接FISH地高辛和二硝基苯酚等标记物以及各种不同颜色荧光素在FISH技术中被广泛利用与PCR技术（提高了制备探针的能力和敏感性）、计算机图像分析技术、流式细胞术、染色体显微切割等技术结合使用，用于细胞遗传学、肿瘤细胞遗传学、遗传病基因诊断等研究中优点操作简单，探针标记后稳定方法敏感能迅速得到结果在同一标本上可以同时检测几个不同的基因可以用于染色体分裂相、培养的间期细胞、组织的石蜡切片、冰冻切片等分类直接法：是用DNA片段作为探针，标记上不同荧光素，在组织切片、间期细胞及染色体标本上与靶核酸进行DNA-DNA原位杂交。常用的荧光素有异硫氰酸荧光素(FITC)、得克萨斯红(Texasred)、Cy3、罗丹明及其衍生物四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethylrhodamineisothiocyanate,TRIT)、氨甲基香豆素醋酸酯（AMCA）等。该方法简单快捷，但信号较弱间接法：用非荧光物质标记的探针，通过亲和连接或免疫反应带入荧光物质来检测杂交体的存在，增加了杂交的敏感性实验操作与用非荧光标记探针的原位杂交基本相似用新鲜、冷冻组织、细胞涂片、培养细胞爬片及中期染色体等进行FISH的结果优于石蜡包埋组织的效果杂交前→变性处理注意荧光素对光和热极为敏感→避光操作，环境温度不能太高尽可能快地在荧光或激光共聚焦显微镜下观察拍照不观察→密闭的盒内保存在-20℃冰箱→5d应用临床：临床细胞遗传学、产前疾病诊断、肿瘤诊断、传染性疾病的诊断、某些遗传病基因携带者的检测、生物学剂量测定研究：基因图谱、基因表达、基因整组的进化、肿瘤生物学、微生物学和病毒学、有丝分裂、减数分裂、复制时间、细胞分类及杂交瘤细胞分析以FISH为基础的新技术分子遗传学多色FISH：直接法：用多种具有可分辨光谱的荧光染料与不同的探针结合，在一个染色体中期分裂象或细胞核中可呈现多种颜色标记间接法：采用三种或三种以上不同的标记物，如生物素、地高辛和二硝基苯酚标记探针，然后用不同颜色荧光素，如FITC(绿色)、罗丹明(红色)和cascadeblue(蓝色)标记抗体进行检测，可在同一标本上同时检测多种DNA序列

纤维FISH技术是将细胞的全部DNA在玻片上制备出高度伸展的染色质DNA纤维，然后用标记不同颜色荧光物质的探针与DNA纤维进行杂交可以快速直接目视判断探针位置以及多个探针间的相对位置、物理位置和重叠程度等，大大加速了基因定位和人类基因组高分辨物理图谱的绘制

PRINS技术用引物引导的原位标记（primedinsitulabeling,PRINS）基本原理：是PCR和FISH的结合。先由寡核苷酸引物或变性DNA片段与细胞内的靶DNA互补序列复性；在聚合酶的作用下，将荧光标记的脱氧核苷酸(如FITC-11-dUTP)带入新合成的DNA中可用于检测罕见的异染色质变异体和评价肿瘤细胞株的染色体异质性1991年Hindkjaer和Koch等，用于在细胞或染色体原位检测特异性DNA或RNA酶标法检测：用地高辛标记，再用免疫组化显色，普通光镜观察也适用于组织切片中DNA或RNA的检测发展多色PRINS技术在同一染色体或细胞标本上，连续进行两次或两次以上的PRINS反应，每次反应采用不同的引物，并分别掺入不同的标记物，通过显色反应，使不同的靶序列呈现出不同的颜色在基因定位、染色体物理框架图的构建方面应用较广应用前景很高的快速性：重复序列DNA可在1h内，单拷贝序列DNA可在3h内得到结果高敏感性和特异性：PRINS是单次延伸，原位PCR为多次循环，因此PRINS可避免非特异性延伸和扩增高稳定性：引物引导作用、特异性片段的延伸和信号显示高简便性：不使用探针，只需要引物高推广性：避免了荧光褪色和使用荧光显微镜的困难→

更广阔的前景第五节人HER-2/neu基因的检测HER-2基因：人类表皮生长因子受体2(humanepidermalgrowthfactorreceptor-2,HER-2)基因，定位于染色体17q12-21.32上，具有酪氨酸激酶活性意义：超过30%的人类肿瘤存在HER-2基因的扩增或过度表达(乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、涎腺肿瘤、胃癌和前列腺癌等)；20-30％的浸润性乳腺癌有HER-2基因的扩增

HER-2癌基因可抑制凋亡，促进增殖；增加肿瘤细胞侵袭力；促进肿瘤血管和淋巴管新生临床应用1998