米曲霉m1产蛋白酶的培养条件优化

米曲霉m1产蛋白酶的培养条件优化

美曲霉是兴化和香料生产中常见的植物。其酶活性直接影响到原料的利用率和产品的质量。因此，提高酶活性对实际生产中起着重要作用。米曲霉产生的蛋白酶包括中性蛋白酶、酸性蛋白酶和碱性蛋白酶,其中中性蛋白酶及碱性蛋白酶在酱油酿造,制酱中发挥的作用更为显著。本试验以十三村食品有限公司所生产的豆瓣酱中分离的一株产蛋白酶活力高的菌株作为出发菌种,通过考察培养基加水量、培养pH值、碳氮源、培养温度、时间、无机盐等因素对米曲霉产蛋白酶酶活的影响,最后利用均匀试验选取最佳工艺条件,进一步提高其产中性蛋白酶的活力。1材料和方法1.1病毒米曲霉PDA斜面菌种M1(十三村食品有限公司所生产的豆瓣酱中分离)。1.1.1培养基菌种用斜面培养基:马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PotatoDextroseAgar,PDA):马铃薯200g,蔗糖20g,琼脂20g,蒸馏水1000mL。固体发酵培养基:麦麸∶水=1∶1(质量比),pH值为6~7(自然pH值)。1.1.2缓冲溶液ph值Folin-酚试剂(实验室配制);干酪素;碳酸钠;三氯乙酸;pH值为7.5磷酸缓冲溶液;pH值为10.5硼酸缓冲液;pH值为3.0乳酸缓冲液;碳源;氮源等,除福林试剂为自己配制外其他均为分析纯试剂。1.2仪器、实验和菌株LDZX-30FB立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂);WFJ7200型可见分光光度计(优尼柯仪器有限公司);精密电子天平,MJ-25085-II恒温霉菌培养箱(上海新苗医疗器械制造有限公司);TD5A高速离心机(长沙英泰器械有限公司);SW-CJ-IFD型单人面洁净工作台(苏州净化设备有限公司)等。1.3测试方法1.3.1不同提取ph值的米曲霉酶活力在浸提过程中,分别用pH值为3.0、4.0、5.0、6.0、7.5、8.5、9.5、10.5缓冲溶液浸提米曲霉麦麸曲制的粗酶液。1.3.2自然ph值对中性蛋白酶活力的影响制曲过程中,麸皮∶水=1∶1(质量比),温度30℃,自然pH值条件下,麦麸曲分别培养24h、30h、35h、42h、48h、68h、72h、96h中性蛋白酶活力。1.3.3中性蛋白酶活力测定制曲过程中,麸皮∶水=1∶1(质量比),自然pH值条件下,麦麸曲分别在培养温度为:20℃、25℃、30℃、35℃温度下培养48h测定中性蛋白酶活力。以下考察培养基起始pH值,培养基加水量,培养基无机盐添加量,碳源、氮源对米曲霉产中性蛋白酶活的影响,培养条件同1.3.3。1.3.4粗酶液的提取准确称取1.000g麦麸曲于烧杯中,加入一定量的缓冲溶液于40℃水浴锅中抽提30min,每5min搅拌1次,最后用4层纱布过滤,滤液即为粗酶液。酶液的稀释倍数根据抽提时加入缓冲液的量来确定,本试验准确称取1.000g麦麸曲,加缓冲溶液200mL,即稀释倍数为200倍。1.3.5g酪氨酸酶活力采用Folin-酚法,酶活定义1g固体酶粉在一定温度下和pH值条件下,1min水解干酪素产生1μg酪氨酸,即为一个酶活力单位,计算公式:X=(A×K×4×n)/10式中X为样品酶活力;A为样品的平均吸光度;K为吸光常数;n为样品稀释倍数;4为反应总体积;10为反应时间10min。1.3.6标准曲线及线性范围在分光光度计波长为680nm时,酪氨酸浓度在0μg/mL~50μg/mL范围内,线性关系良好。其回归方程为y=0.0088x,R2=0.9979。标准曲线见图1。2结果分析2.1活力不高，活力较低如图2所示,在pH值为3~5时,蛋白酶霉活力变化平稳,且活力较低。蛋白酶活力逐渐增大,至pH值为7.5左右达到最大9153.61U/g干基,然后逐渐降低。表明该米曲霉产生的蛋白酶主要为中性蛋白酶,其次为碱性蛋白酶和酸性蛋白酶。2.2中性蛋白酶活力如图3所示,培养24h后,随着培养时间的增加,中性蛋白酶活力迅速增加,48h趋于平稳,培养至72h达到最大值,随后中性蛋白酶活力稍稍有所降低。表明在该条件下,产中性蛋白酶的最适培养时间为72h。2.3初始培养温度对培养基酵母和蛋白酶活性的影响结果表明:在培养条件完全一致的条件下培养72h,测定米曲霉产中性蛋白酶的活力。培养温度30℃时最高。在温度为20℃时米曲霉生长比较缓慢,培养48h培养基上才见白色菌丝。而在30℃培养温度下,24h培养基上长出白色丝,48h培养基上呈现黄色,孢子不丰富,培养72h培养基呈现黄绿色,长出丰富的孢子。培养温度为35℃,蛋白酶活性比较低,主要原因可能为初始培养温度过高使酶的稳定性下降,造成酶活力降低。因此,培养温度为30℃为该米曲霉最适培养温度,这与资料报道相符。2.4菲比妥酸ph值对米曲霉产中毒酶的影响不同起始pH值发酵培养基培养的米曲霉的蛋白酶活力测定结果见表2。结果表明,培养pH值宜在4~6,pH值在5左右酶活力最高。2.5中性蛋白酶活力随加水量的变化水是微生物生长及代谢反应的必需物质,不同加水量对酶活的影响,结果见表3。结果表明,随着加水量的增加,米曲霉中性蛋白酶活力逐渐增加。当加水量为1∶1时,其酶活力达到最大,而后随着加水量的逐渐增加,酶活逐渐下降。2.6其它无机盐的添加量对米曲霉中性蛋白酶未发挥作用的影响无机盐是微生物生长及代谢反应的必需物质,添加一定量不同无机盐对酶活的影响,结果见表4。结果表明,添加硫酸铵、硝酸钾、磷酸氢二钠对米曲霉中性蛋白酶的产生有一定的促进作用,其它无机盐的添加对产酶的影响不明显。其中添加0.02%硫酸铵、0.2%硝酸钾对米曲霉产中性蛋白酶影响最显著分别达到10760.73U/g干基、10632.98U/g干基。2.7碳源和氮源对米曲霉产中酶活性的影响结果表明,酵母粉、蛋白胨、麦芽糖、葡萄糖的添加对米曲霉中性蛋白酶的产生有明显的促进作用,其它碳源、氮源对产酶影响不明显。2.8米曲霉中性蛋白酶活性的测定根据以上结论,在培养温度为30℃,培养时间为72h,加水量为50%,自然pH值条件下,试验选择对米曲霉产中性蛋白酶促进作用大的6个生长因子:x1(酵母粉)、x2(蛋白胨)、x3(硝酸铵)、x4(麦芽糖)、x5(葡萄糖)、x6(硫酸铵)考察对米曲霉产中性蛋白酶的影响,因素水平见表6。利用DPS软件设计U10(106)均匀试验表进行试验,试验过程中按随机抽取的方式对不同组中性蛋白酶活性进行测定,测定结果见表7。利用DPS7.55数学统计软件对上表的试验数据进行拟合,得米曲霉中性蛋白酶与各因素关系的数学模型为:显著水平为p=0.0041;相关系数为R=1.0;F=36046.32因此该模型可以应用。决定相关系数R2=1.0;剩余标准差SSE=10.70;调整后的相关系数Radj=1.0;Durbin-Watson统计量d=1.8938,根据回归方程求出最佳组合见表8。根据均匀试验的结果与实际试验进行拟合,按表8进行3次重复试验测定米曲霉中性蛋白酶的酶活分别为11580.39U/g干基,11840.69U/g干基,12131.85U/g干基,说明均匀试验结果在实际操作性好,试验结果也预测基本吻合。因此确定培养基组成为麸皮∶水=1∶1(w/w);酵母粉添加量为2.0%;蛋白胨添加量为0.20%;硝酸钾添加量为0.1%;麦芽糖添加量为0.1%;葡萄糖添加量为0.1%;硫酸铵添加量为2.0%。3培养基的构建研究表明,米曲霉产中性蛋白酶的能力最强。米曲霉产中性蛋白酶适宜的培养条件为:麸皮∶水(w/w)=1∶1,最佳培养温度为30℃,培养时间为72h,培养基组成为:酵母粉添加量2.0%、蛋白胨添加量0.2%、硝酸钾添加量0.1%、麦