第17章 体内药物分析简介

第十七章体内药物分析简介第一节概述

一、体内药物分析的性质

体内药物分析（生物药物分析）是药物分析的重要分枝，是随着临床药学、临床药理学的发展和需要而建立起来的综合性的应用学科。体内药物分析——研究药物在体内的“命运”通过分析手段了解药物在体内数量与质量的变化，获得药物动力学参数和代谢的方式、排泄的途径等信息，为临床药学研究提供必要的数据和相关信息,有助于药物生产、研究、临床应用等方面对药物作出估计与评价。如果没有体内药物分析提供的数据和相关信息，进行临床药学研究是不可想象的。体内药物分析是一门研究生物机体中药物及其代谢物和内源性物质的在体内质与量变化规律的分析方法学意义：（一）新药评价和开发中的意义（二）临床合理用药中的意义（三）药物作用机制探讨药物质量评价的安全性、有效性（四）代谢分型研究中应用三、体内药物分析的对象和任务分析物：主要生物样品中的药物、体内代谢物、活性的代谢物、内源性物质生物样品对象:人体和实验动物生物样品种类:体液（血液、尿液、唾液），另外还有头发和器官组织等。体内药物分析的任务1.分析方法学的研究和完善

提供灵敏、专属、准确的分析方法与最佳分析条件

2.为药物体内研究提供数据提供药物在动物和人体内的药物动力学参数、生物利用度及血浆蛋白结合率等基本数据3.为临床治疗药物监测提供准确的血药浓度测定值—提供药学情报和信息,参与临床科学用药,确定最佳剂量,制定治疗方案.4.体内内源性物质的测定和研究氨基酸、激素、肌酐、草酸、尿酸等在体内一定浓度范围内含量变化指示机体病变—为某些疾病的诊断及治疗提供重要信息5.滥用药物的检测—为吸毒者体内毒品和运动员体内禁药的测定提供分析方法和可靠数据.

体内药物分析的特点与要求一、体内药物分析的特点1．干扰物质多2．样品量少、不能重复取样3．被测成分浓度低,对分析方法的灵敏度和专属性要求较高.4．有时需要测定缀合物和代谢产物.5.供药物浓度监测的分析方法要求简便、快速６.工作量大，要有一定的仪器设备二、分析方法的新要求1.

检测方法的高灵敏度（最低检测量10-9~10-7g甚至10-15~10-12g）2.

分离方法的高选择性、高专属性3.分析方法应达到要求的精密度、准确度,具有稳定且较高的回收率4.求解出实验与临床上有意义的参数体内药物分析的发展概况

及热点问题

一、体内药物分析的发展概况20世纪60年代—临床药理学与生物药剂学的建立70年代初—体内药物分析在国外开始建70年代末—血药浓度监测广泛用于临床80年代—体内药物分析学科日趋成熟90年代—微量、超微量分离、分析技术应用

第二节生物样品的种类、采集和制备

生物样品种类脏器组织：体液：血液、尿液、唾液、毛发、乳汁、精液、脑脊液、泪液、胆汁、胃液、胰液、淋巴液、粪便等最常用的生物样本

尿液—用于药物剂量回收、尿清除率、生物利用度、内源性活性物质、药物代谢分型及代谢物等的研究测定唾液—用于某些S/P较为恒定的药物的测定

毛发—可用于药物滥用监测及微量元素测定肝、胃、肾、肺、脑等脏器组织—动物试验研究药物吸收、分布状态及服药过量中毒死亡1.血样的采集一般用注射器直接采集静脉血，每次1~5ml；动物实验时，采血量不宜超过动物总血量的十分之一

注：测定血中药物的浓度，通常是指测定血浆或血清中的药物浓度，尤其是血浆，并非指全血血浆的制备采集的静脉血液置含有抗凝剂的试管中，混合后，以2500~3000r/min离心5~10min使与血球分离，所得淡黄色上清液即为血浆（plasma）

血清的制备

采集的静脉血液置试管中，于37℃或室温放置30min~1h。血液凝固后，用细竹棒或玻璃棒轻轻剥去试管壁上的血饼，再在2500~3000r/min离心5~10min，上层淡黄色液体即为血清（serum）

血清比血浆只是少一种纤维蛋白原C血浆=C血清血浆比血清的分离快，而且制取量约为全血的50%~60%（血清为全血的20%~40%），多数用血浆进行分析。若血浆中含有的抗凝剂对药物浓度测定有影响时，则应使用血清样品

全血的制备成分：血浆有形物质：红细胞白细胞血小板全血的制备将采集的血液置含有抗凝剂的试管中，但不经离心操作，保持血浆和血细胞均相状态，即为“全血”（wholeblood）

某些情况血浆内药物浓度波动大，或血浆浓度低，可用全血（全血净化较血浆和血清麻烦）血浆和红细胞中分配比不是常数，则应使用全血样品

血样主要应用于：

药物动力学

生物利用度

临床治疗药物浓度监测（二）尿液(urine)

尿液用于：药物剂量回收、药物尿清除率、生物利用度的研究，预测药物代谢过程、类型体内药物清除主要是通过尿液排出，药物以原型、Ⅰ相及Ⅱ相代谢物等多种形式排出性状—淡黄色或黄褐色，相对密度1.105~1.020，pH4.8~8.0成分—水、含氮化合物、盐类等微生物—防腐剂尿液的采集

样本来源—自然排尿，成人一日排尿量为1~5L（随时尿、晨尿、白天尿、夜间尿及时间尿）

样本采集—一般采集时间尿（规定时间内采集尿液体积和排入尿中的药物总量（三）唾液（saliva）

唾液—无损伤取样，易收集；一些药物的唾液药浓(S)与血浆游离药浓(P)密切相关，因此： —TDM中利用对S的测定代替对P的监测 —药代动力学的研究唾液采集

在潄口后15min，安静状态下采集口腔内自然流出的唾液；也可在刺激下快速采样(需注意干扰)

唾液样品采集后，应立即测量其除去泡沫部分的体积，以3000rpm离心10min，取上清液直接测定或冷冻保存 生物样品的贮存与处理冷藏—冰箱(4℃)中短期保存(1~2d)冷冻—冷柜(-20℃)或低温冷柜(-80℃)中长期保存注：冷藏或冷冻时限经稳定性考察后确定血样：采集后及时分离血浆和血清（≤2h），分离后再贮存—若不予先分离，血凝后冰冻保存，则因冰冻有时易引起细胞溶解，会阻碍血浆或血清的分离—置硬质玻璃试管中完全密塞后保存尿样

采集后应立即测定，若不能立即测定，加入防腐剂后保存 常用防腐剂：甲苯、二甲苯、氯仿、醋酸、浓盐酸等 甲苯在尿液表面形成薄膜醋酸改变尿液酸碱性抑制细菌的生长 保存时间为24~36h(4℃)或长期(-20℃)唾液

为阻止酶催化生成粘蛋白，应在4℃以下保存 —保存过程中放出二氧化碳而使pH升高，测定唾液pH时应在取样的当时为好—冷冻保存唾液时，解冻后有必要将容器内唾液充分搅匀后再用，否则测定结果会产生误差

第三节生物样品的预处理与制备样品预处理技术

分离、纯化、富集或化学衍生化等，为药物的最终测定创造良好的条件

样品的预处理是体内药物分析中极为重要的环节；也是分析中最困难、最繁杂的工作

——对于生物样品的预处理很难规定固定的程序和方式，必须结合测定实际和要求，采取恰当的方法和技术一、生物样品预处理的目的

使药物从缀合物及结合物中释放

——定药物的总浓度

使样品纯化——消除生物基质中内源性物质的干扰

提高检测灵敏度——适应和符合测定方法要求的灵敏度

防止分析仪器的污染和劣化——提高分析仪器的耐受程度、改善分析结果二、方法的选择

待测生物样品的类型决定样品预处理方法：

血浆、血清——常需去除蛋白质 唾液——主要采用离心沉淀除去粘蛋白 尿液——常采用酸或酶法使缀合物水解 头发——需要将头发进行有机破坏后测定微量元素1.药物的理化性质和存在形式酸碱性(pKa)、溶解性——提取性质挥发性——挥发损失及气相色谱法的应用光谱特性——分析仪器的选择官能团性质——化学衍生化和检测器应用化学稳定性——处理条件的选择存在形式及血浆蛋白结合率——预处理方法

2.待测药物的浓度范围不同药物在体内中浓度相差极为悬殊 ——地高辛治疗血浓为1~2ng/ml ——水杨酸盐治疗血浓为20~100

g/ml 浓度大——预处理要求稍低 浓度低——样品制备要求高3.药物测定目的药物测定目的不同——样品预处理的要求不同： 急性中毒病例——要求快速鉴定所怀疑的药物，应在尽可能短的时间内获得其浓度的数据，对样品预处理的要求可以粗放些

测定药物及代谢物——要求使代谢物从缀合物中释放出来并在不同pH介质中分离获得酸性、中性或碱性代谢物，对样品预处理的要求全面、细致5.样品预处理与分析技术的关系

1.分析方法特点(是否专属、是否具有分离能力)2.检测系统对杂质污染的耐受程度决定样品预处理和需要净化的程度三、生物样品的预处理与制备技术

（一）有机破坏法

应用——微量元素测定方法

1．湿法破坏 2．干法破坏 3．氧瓶燃烧法1.湿法破坏

常用试剂—硝酸或硝酸-高氯酸

特点—破坏能力强、反应激烈，无机金属离子为高价态

应用—适用于血、尿、组织等生物样品的破坏

缺点—含氮杂环药物的破坏不够完全注意—切勿蒸干、以免爆炸样品用量—金属元素量10~100

g，血样10~15ml、尿样50ml2、干法破坏高温炉高温破坏应用——适合人发样品的破坏3.氧瓶燃烧（oxygenflaskcombustion）

特点——操作简单、快速、设备简单 应用——血浆、人发中卤素、硫、硒等

血浆：血浆1ml分次点于无灰滤纸上→60℃烘干→按规定折叠后固定 人发：洗净、干燥（60℃~80℃）→剪碎→称取0.1~0.3g置无灰滤纸中心→按规定折叠固定

（二）去除蛋白质非破坏性生物样品预处理的第一步可使结合型药物释放

1.去除蛋白后取上清液直接分析测定2.去除蛋白后取上清液经进一步分离纯化、浓集后分析测定去除蛋白质的方法

1.加入与水混溶的有机溶剂—蛋白质脱水沉淀2.加入中性盐—“盐析”沉淀蛋白质3.加入强酸—与蛋白质阳离子(铵基)形成不溶性盐沉淀4.加入重金属盐—与蛋白质阴离子(羧基)形成不溶性盐沉淀5.超滤法—半透膜滤除可溶性生物大分子物质(蛋白质)6.酶水解法—蛋白分解酶分解蛋白质7.加热法—蛋白质变性凝固1.加入与水相混溶的有机溶剂

常用有机溶剂:乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃血样与溶剂体积比—1∶(1~3)可除去90%以上蛋白

乙腈—块状絮凝物、易于分离；成分损失可能性大，上清液pH为8.5~9.5甲醇—细小颗粒沉淀、不易分离；成分损失可能性小，上清液pH为8.5~9.5超速离心分离（12000r/min)—离心1~2min

2.加入中性盐常用中性盐—饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐及枸橼酸盐等试剂用量—血清与饱和硫酸铵比例为1∶2时除去90%以上的蛋白质分离—高速(12000r/min)离心上清液pH7.0~7.73.加入强酸常用的强酸——10%三氯醋酸、6%高氯酸、5%偏磷酸等试剂用量——血清与强酸比例为1∶0.6时，除去90%以上的蛋白质分离——高速(12000r/min)离心1~2min，上清液pH0~4过量三氯醋酸——煮沸分解为氯仿和二氧化碳高氯酸——碳酸钾、醋酸钾或氢氧化钠等中和后加乙醇使产生高氯酸钾（钠）沉淀4.加入含锌盐及铜盐的沉淀剂

当溶液pH高于蛋白质的等电点时，蛋白质分子中带阴电荷的羧基与金属阳离子形成不溶性盐沉淀 常用沉淀剂—CuSO4-Na2WO4、ZnSO4-NaOH血清与沉淀剂比例—1∶(1~3)， 分离—高速(10000r/min)离心，上清液pH分别为5.7~7.3和6.5~7.55.超滤法性质—以多孔性半透膜(超滤膜)作为分离介质的一种膜分离技术；特点—无需加热；无需添加化学试剂；无相变化；无破坏性应用—游离药物首选方法操作—分子量截留值在5万左右的超滤膜过滤可将分子量大的血浆蛋白以及结合了的药物的血浆蛋白分离

6．酶水解法

加入适量的酶和缓冲液，置水浴上水解一定时间，过滤或离心，取上清液供萃取用 最常用的酶—蛋白水解酶中的枯草菌溶素可在较宽的pH范围(pH7.0~11.0)内使蛋白的肽键降解，在50~60℃具有最大活力7.

加热法

测定对热稳定性好的组分时，可采用加热的方法将一些热变性蛋白沉淀 加热温度视欲测组分的热稳定性而定，通常可加热到90℃；蛋白沉淀后可用离心或过滤除去 优点——方法最简单 缺点——只能除去热变性蛋白（三）溶剂提取溶剂选择—合适的溶剂是成功的主要条件①了解药物与溶剂的化学结构及其性质—相似相溶的原则②对药物未电离分子可溶，电离形式分子不溶③沸点低、易挥散，毒性小与水不相混溶④不影响紫外检测⑤具有较高的化学稳定性和惰性有机溶剂萃取次数—通常为1次，必要时2~3次有机溶剂每次用量—与水相体积比通常为1:1或2~5:1通过萃取回收率确定最佳萃取次数与每次的溶剂用量水相pH值:

由药物的pKa确定碱性药物最佳pH值高于