辐射生物学研究方法

细胞学检测分子生物学检测辐射生物学研究方法细胞克隆实验TheClonogenicAssay克隆实验最早是细菌物学家用来检测细菌存活的一种实验手段。Puck和Marcus将此方法引入到细胞生物学中单个细胞在petridish中生长并形成一个肉眼可见的克隆辐射生物学研究方法细胞细胞辐照受损伤未受损伤克隆克隆细胞克隆实验TheClonogenicAssay辐射生物学研究方法细胞克隆实验TheClonogenicAssay辐射生物学研究方法5细胞克隆实验TheClonogenicAssay辐射生物学研究方法Hela细胞的辐射-存活曲线第一个发表的哺乳动物存活曲线细胞克隆实验TheClonogenicAssay辐射生物学研究方法7细胞活力实验MTTAssay辐射生物学研究方法MTT（3-(4，5)-dimethylthiahiazo(-z-yl)-3，5-di-phenytetrazoliumromide

），又名噻唑蓝MTT琥珀酸脱氢酶黄色甲臜

蓝紫色结晶DMSO溶解后570nm测OD值MTT一种黄色化合物，能接受氢离子的染料。在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的甲臜（formazan）结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）MTT工作液制备（5mg/ml）：MTT粉末+PBS0.22μm滤膜过滤除菌及杂质，4℃避光保存吸取待测细胞的原培养基，按一定比例（一般为0.5%MTT）加入新鲜培养基和MTT工作液，37℃继续培养4h吸取培养基与MTT混合物，加入DMSO溶解细胞内结晶酶标仪570nm出测定OD值8细胞活力实验MTTAssay辐射生物学研究方法

处理组的OD570细胞活性（%）=x100%

对照组OD570细胞活力实验MTTAssay辐射生物学研究方法实验过程中注意避光MTT和DMSO对实验者均有伤害，注意戴手套测定OD值时注意对照和空白的设置，空白一般用蒸馏水（DIwater）即可为保证结果的线性，MTT吸光度最好在0-0.7之间ClonogenicAssayMTT细胞活力实验MTTAssay辐射生物学研究方法流式细胞术（FlowCytometry

）FCM是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的技术FALSSensorLaser辐射生物学研究方法

流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。

细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量辐射生物学研究方法

流式细胞仪的分析及分选原理工作原理：

FCM是一种在计算机技术支持下的高度自动化的细胞显微荧光脉冲分光光度仪。基本组成结构：液流系统：样品流和鞘流光学系统：激光、透镜组、光电倍增管等。数据处理系统辐射生物学研究方法InjectorTip荧光信号激光束Sheathfluid样品流和鞘流液流系统辐射生物学研究方法流动室LaserFlowCell孔径50-200

m检测区离喷口200

m有分选功能辐射生物学研究方法PMTPMTPMTPMTDichroicFiltersBandpassFiltersLaser1234Flowcell

激光、透镜组、光电倍增管等光学系统

辐射生物学研究方法细胞组成细胞功能大小细胞表面/胞浆/核--特异性抗原粒度细胞活性DNA,RNA含量胞内细胞因子蛋白质含量激素结合位点钙离子,PH值,膜电位酶活性流式细胞仪常检测的细胞特性辐射生物学研究方法荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管。选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。线性放大器和对数放大器荧光测量辐射生物学研究方法荧光测量辐射生物学研究方法FITCTexasredPE.PC.APCPEcy5FL1FL2FL3FL4激光细胞悬液异硫氰酸荧光素得州红能量传递复合染料藻胆蛋白类几种常见的荧光染料辐射生物学研究方法荧光染料激发波长（nm)发射波长（nm)颜色FITC488525深蓝色PE(RDI)488575橙色ECD488620橙红色PeCy-5488670红色PeCy-7488755深红色PI488620橙红色APC633670红色几种常见的荧光染料辐射生物学研究方法流式细胞仪测定细胞周期时相原理：细胞内的DNA含量随细胞周期进程发生周期性变化，如G0/G1期的DNA含量为2C，而G2期的DNA含量是4CPI（PropidiumIodide）：一种溴化乙啶的类似物，在嵌入双链DNA后释放红色荧光。PI-DNA复合物的激发和发射波长分别为535nm和615nm利用PI标记，通过流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时相的百分比辐射生物学研究方法实验步骤待测细胞酶解收集单细胞悬浮液PBS洗涤后，70%预冷乙醇，4℃避光固定30min加BSA，重悬细胞于PBS，离心去上清重悬细胞于含RNA酶的PBS缓冲液中，37℃避光处理30min加PI染色，过滤后上流式细胞仪分析辐射生物学研究方法流式分析细胞周期时相分布辐射生物学研究方法

细胞实时摄像技术辐射生物学研究方法LiveCellImagingByPhase,DIC&PolMicroscopyImmunofluorescenceMicroscopyofMicrotubules(Green)&Chromosomes(Red)InMitoticPtK1Cell

细胞实时摄像技术辐射生物学研究方法优点：可以得到准确的细胞周期时间及分裂间期和分裂期的准确时间缺点：缺乏对细胞群体的指征性

细胞实时摄像技术辐射生物学研究方法碱基变化脱氧核糖变化DNA链断裂—单链断裂（SSB）双链断裂（DSB）交联—DNA链交联

DNA-蛋白质交联

其中DSB是辐射所致生物学效应中最重要的原初损伤，而非重接性的DSB则被认为是细胞杀伤效应的最重要的损伤电离辐射致DNA分子的变化辐射生物学研究方法DNA链断裂示意图单链断裂双链断裂单链断裂：是DNA双螺旋结构中一条链断裂双链断裂：是DNA的两条互补链于同一对应处或相邻处同时断裂辐射生物学研究方法凝胶电泳原理：DNA带负电，外加电场后，DNA片段会在凝胶中移动且移动的速度跟片段大小有关步骤：制胶点样电泳染色观察DNA分子种类线状DNA—单链与双链，ss-DNA电泳时要注意局部区域形成ds-DNA，造成迁移距离不确定环状DNA—单链（如M13mp）和双链（质粒DNA）线状ds-DNA电泳—使用频率最高的一种电泳环状ds-DNA电泳:常用于质粒DNA的初步鉴定线状ss-DNA电泳辐射生物学研究方法单细胞凝胶电泳或彗星试验原理：由RybergB和JonhansonKJ首先提出后又经SinghNP和OlivePI进一步完善的一种在单细胞水平上检测DNA损伤与修复的方法。因其细胞电泳形状颇似彗星，又称彗星试验(cometassay)。它是一种测定和研究单个细胞DNA链断裂的新电泳技术，与传统方法相比，其简便、快速、灵敏、样品量少、无需放射性标记，具有极高的实用价值。目前该技术已广泛地应用于体内、体外各种有核细胞经受试物诱导的DNA损伤和修复的研究辐射生物学研究方法辐射生物学研究方法实验步骤辐射生物学研究方法辐射生物学研究方法定义：微核(Micronucleus)的产生与染色体损伤有关，是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺锤丝受损伤而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质内，因比主核小，故称微核微核试验(Micronucleustest，MNT)是观察受试物能否产生微核的试验。其主要可检出DNA断裂剂和非整倍体诱变剂微核试验辐射生物学研究方法实验原理细胞质中微核来源：断片或无着丝粒染色体在细胞分裂后期不能定向移动，而遗留在细胞质中；有丝分裂毒物的作用使个别染色体或带苔丝粒的染色体环和断片在细胞分裂后期被留在细胞质中。辐射生物学研究方法实验步骤37辐射生物学研究方法统计1000个以上双核细胞内含有微核的细胞占的比例

含有微核的双核细胞数微核率=×1000‰

含有双核细胞的总数结果统计辐射生物学研究方法MNNCE辐射生物学研究方法简介：荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术,以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法,探针首先与某种介导分子(reportermolecule)结合,杂交后再通过免疫细胞化学过程连接上荧光染料.

荧光原位杂交（FISH）辐射生物学研究方法原理：用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位优点：与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点41辐射生物学研究方法根据所用的探针和靶核酸的不同可分为三类：

DNA-DNA杂交；

DNA-RNA杂交；

RNA-RNA杂交。根据探针的标记物是否能直接被检测可分为两类：直接法：探针用放射性同位素、荧光素或一些酶标记，当与组织细胞内靶核酸形成杂交体后，可分别通过放射性自显影、成色的酶促反应、荧光等来显示靶核酸的位置。

间接法：一般都是用半抗原来标记探针，如生物素、地高辛等，然后通过用免疫组织化学对半抗原的定位，间接地显示探针与组织细胞内靶核酸所形成的杂交体。辐射生物学研究方法探针及标本的变性：DNA变性成单链杂交：探针与待测样本充分结合洗脱：洗去未结合探针杂交信号的放大封片：延长保存时间荧光显微镜观察FISH结果实验步骤辐射生物学研究方法整条染色体涂染通过整条染色体涂染判断易位染色体辐射生物学研究方法荧光染色检测DSB原理：DSB产生时，会有特异性蛋白53BP1以及γ-H2AX产生，利用这两种蛋白的抗体进行原位免疫荧光染色，通过荧光显微成像术获得细胞及特征蛋白的荧光图像后,分析图像中阳性细胞的比例来评估旁细胞的损伤程度辐射生物学研究方法辐射生物学研究方法辐射生物学研究方法概念:两个不同来源的、含有互补核苷酸顺序的单股核酸分子，通过碱基配对形成一个新的、稳定的双股分子的过程原理:核酸经加热变性后，低于变性温度20℃-30℃时，反应系统中加入的核酸探针与待测核酸样品中具有互补序列的单链DNA或RNA形成双链结构，通过检测标记信号即可检测特定的核苷酸片段核酸杂交技术辐射生物学研究方法核酸杂交原理图辐射生物学研究方法根据标记物的性质分：

放射性标记:32P,35S,125I,3H

非放射性标记：化学发光标记、酶标记、荧光标记等敏感度高，半衰期短（32P14.3天，35S87.1天，125I60天，3H的半衰期长达12.3年，但它所释放β放射线能量太低，只能用于组织原位杂交），有辐射危害探针的分类辐射生物学研究方法探针的分类根据探针中核酸的性质分：DNA(包括cDNA)探针RNA探针(包括cRNA)寡核苷酸探针肽核酸（peptidenucleicacid,PNA）探针辐射生物学研究方法实验步骤辐射生物学研究方法核酸限制性内切酶原理：限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA辐射生物学研究方法四类限制性内切酶识别位点及产物辐射生物学研究方法DNA1μg反应10×缓冲液2μL重蒸水19μL1μL酶液+用手指轻弹管壁使溶液混匀，使溶液集中在管底混匀反应体系后，37℃水浴保温2-3h每管加入2μL0.1mol/LEDTA(pH8.0)，电泳检测EP管编号,加样实验步骤辐射生物学研究方法

SouthernBlotting

NorthernBlotting辐射生物学研究方法SouthernBlotting膜上检测DNA的杂交技术，1975年由EdwinSouthern建立。将待测DNA序列结合到一定的支持物上，然后与存在于液相中的核酸探针分子进行杂交的过程，是目前最常用的一种核酸分子杂交方法辐射生物学研究方法印迹方法虹吸印迹法真空转移法电转移法辐射生物学研究方法虹吸转移法利用毛细管的虹吸作用由移动缓冲液带动核酸分子转移至滤膜上辐射生物学研究方法利用真空泵将转移缓冲液从上层容器中通过凝胶抽到下层真空室中，同时带动核算分子快速转移到凝胶下面的滤膜上。该法的最大优点是快速，转膜的同时进行DNA的变性和中和，整个过程只需1h左右真空转移法辐射生物学研究方法电转移法辐射生物学研究方法实验步骤核酸的制备电泳印迹预杂交杂交洗膜检测辐射生物学研究方法NorthernBlottingNorthernBlotting是将RNA样品变性和通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，再转移到硝酸纤维素膜等固相载体上，用标记的DNA或RNA特异探针针对固定在膜上的RNA进行杂交。其基本原理与SouthernBlotting相同，只不过变性方法不能采用碱变性法（碱会导致RNA水解），一般采用聚乙二醛和二甲基亚砜、甲醛等变性法。主要用于分析mRNA的转录或者mRNA分子的大小辐射生物学研究方法原理，方法及步骤与SouthernBlotting类似NorthernBlotting辐射生物学研究方法定义：是通过模拟体内DNA复制的方式，在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩增出来的技术，由美国科学家KaryB.Mullis提出原理：PCR技术是在模板DNA、引物（人工合成）、Mg2+和4种脱氧核糖核苷酸（dNTP）存在的条件下，利用DNA聚合酶（Taq酶）催化作用，经过DNA变性、引物与模板结合（复性）和延伸的循环过程，体外大量扩增特异DNA片段PCR定义及原理辐射生物学研究方法PCR反应混合物

引物Mg2+Mn2+dCTPdGTPdUTPdATPTaqDNA多聚酶rTthDNA多聚酶AmpErase（UNG酶）

和或和辐射生物学研究方法实验步骤引物设计与合成DNA模板的变性模板与引物的结合（退火或复性）引物延伸以上为一次PCR循环（变性、复性和延伸），新合成的链可作为下一轮循环的模板辐射生物学研究方法逆转录PCR（RT-PCR）

以反转录的cDNA作模板所进行的PCR，可对基因的表达和序列多态性分析辐射生物学研究方法原理：通过特定设计的PCR仪器来实时检测PCR扩增过程中每一轮循环产物的累积数量，可以很好的推算模板的起始浓度，这种工作方式称为实时定量PCR荧光标记方式QuantitativeReal-timePCRSYBR荧光染料（SYBRgreenⅠ)TaqMan探针发夹型杂交探针辐射生物学研究方法5’TaqMan®ProbeForwardPrimer5’3’5’3’5’ReversePrimer5’3’5’5’3’5’ForwardPrimerReversePrimerPolymerizationDisplacementQRRQQuantitativeReal-timePCR辐射生物学研究方法Cleavage5’3’5’3’5’5’5’3’5’5’3’5’PolymerizationCompletedRQ3’3’RQQuantitativeReal-timePCR辐射生物学研究方法标准曲线可作为判断模板起始浓度的依据一般以质粒梯度稀释再进行PCR得到辐射生物学研究方法DNA介导的基因转移研究与辐射相关基因最好的方法就是将该基因转入自身无表达的细胞系中，再通过基因的表达情况以及细胞的应激调控来确定该基因的功能辐射生物学研究方法微注射：通过毛细管直接将外源DNA注射入宿主细胞核内。但难度大，每次只能对一个细胞进行操作，效率低磷酸钙沉淀：磷酸钙能使DNA沉淀形成大的聚合物，某些细胞能摄入这种形式的DNA。该方法最为经典，但原理尚未知电穿孔：短时间的电脉冲处理能在悬浮细胞的膜上形成暂时打开的孔洞，为外源基因的进入打开了通道。该法适合磷酸钙沉淀法无法处理的细胞病毒载体：逆转录病毒携带的遗传物质是RNA，当转入宿主体内后，在病毒逆转录酶的作用下转成DNA，再掺入宿主的基因组内，同宿主基因一起复制，转录。缺点是转导的外源基因大小受限制脂质体：将DNA包裹在人工制备的磷脂双分子层的膜状结构内，通过脂质体与细胞膜的融合而将DNA导入细胞内DNA介导的基因转移辐射生物学研究方法DNA文库定义：某一特定来源DNA通过细胞－DNA克隆技术构建呈含有所用DNA片段的重组DNA分子，并转化至细菌内，构成DNA文库。依据DNA的来源不同，可分为，基因组DNA文库和cDNA文库cDNA文库：某种生物的基因组的转录部分或全部的mRNA经反转录，产生大量的cDNA片段，然后通过克隆载体，将这些cDNA片段贮存在一个受体菌的群体中，这个群体就是这种生物的cDNA文库辐射生物学研究方法1）提取研究对象基因组DNA,制备合适大小的DNA片断，或提取组织或器官的mRNA并反转录成cDNA2）DNA片段或cDNA与经特殊处理的载体连接形成重组DNA3）重组DNA转化宿主细胞或