几种保护氨基酸和赖氨酸的合成及性能研究

几种保护氨基酸和赖氨酸的合成及性能研究

对于高产牛来说，微生物蛋白和非分解蛋白的氨基酸是不够的。灌注试验证明,大多数情况下,奶牛第一、二限制性氨基酸为蛋氨酸和赖氨酸,需要补充能够在小肠吸收的满足奶牛代谢需要的蛋氨酸和赖氨酸,但日粮中直接补充游离蛋氨酸和赖氨酸大部分会在瘤胃中被降解,导致进入小肠的蛋氨酸和赖氨酸减少;通过真胃和十二指肠灌注,给奶牛带来很大的负担和应激,并且也不适合于生产。研制过瘤胃保护蛋氨酸和赖氨酸产品对奶牛氨基酸营养深入研究有重要意义。本研究利用4种材料包被蛋氨酸和赖氨酸,并对其稳定性进行了体外和尼龙袋两种方法的检验,筛选出稳定性好的瘤胃保护蛋氨酸和赖氨酸各一种,并观测体外法与尼龙袋法测定结果的差异及分析体外法代替体内法的可能性。1材料和方法1.1日粮营养水平选用4头装有永久性瘤胃和十二指肠瘘管的荷斯坦干乳牛。日喂两次(08:00和20:00),日粮组成:玉米10.60%,豆粕3.64%,麦麸3.00%,棉粕2.00%,石粉0.20%,磷酸氢钙0.20%,食盐0.16%,预混料0.20%,羊草60%,苜蓿干草20%。日粮营养水平:NEL5.1757MJ/kg,CP13.12%,钙0.8127%,磷0.3293%。每次饲喂精料2kg,羊草6kg,苜蓿草2kg,自由饮水。1.2化学试剂及试剂DL-蛋氨酸由日本住友化学株式会社提供(含量99%),L-赖氨酸盐酸盐由泰国味之素有限公司提供(含量98.5%),丙烯酸树脂Ⅳ号由上海浦力膜制剂辅料科技合作公司提供,乙基纤维素由国药集团化学试剂有限公司提供,氢化植物油由上海赫力斯特化工有限公司提供,羟丙基甲基纤维素由山东聊城阿华制药有限公司提供。保护蛋氨酸由丙烯酸树脂Ⅳ号,丙烯酸树脂Ⅳ号和乙基纤维素,丙烯酸树脂Ⅳ号和乙基纤维素及羟丙基甲基纤维素,乙基纤维素,丙烯酸树脂Ⅳ号和氢化植物油,氢化植物油分别包被,形成产品M1、M2、M3、M4、M5、M6。保护赖氨酸由丙烯酸树脂Ⅳ号和乙基纤维素,丙烯酸树脂Ⅳ号和羟丙基甲基纤维素,丙烯酸树脂Ⅳ号和氢化植物油,乙基纤维素和氢化植物油包被形成产品L1、L2、L3、L4。1.3测试方法1.3.1缓冲液对氮的释放率测定体外试验方法根据Papas等提供的方法进行,准确称取1.0g产品放入50mL具塞试管底部,分别加入20mLpH6.6、pH2.4的缓冲液,盖紧试管塞,在39℃恒温水浴锅内消化0、4、8、24、48h,过滤,凯氏定氮法测定溶液中氮含量,以氮的消失率计算释放率。1.3.2瘤胃投入量准确称取3g产品放入12cm×8cm尼龙袋中(孔径为35～50μm),于晨饲时投入瘤胃,每头牛12个袋。放置后于4、8、24、48h取出尼龙袋,每一种保护性氨基酸每个时间点4个重复,取出尼龙袋后用中等流速的自来水冲洗干净,烘干,称重,用凯氏定氮法测定尼龙袋中残留的氮含量,以氮的消失率计算释放率。1.3.3剩余样品的释放率测定真胃和小肠释放率根据Rossi等采用的移动尼龙袋法进行,将1g样本放入6cm×2.5cm小尼龙袋,放入39℃、pH为2的0.2%的HCl-胃蛋白酶溶液中2.5h,然后放入十二指肠瘘管内,从粪中回收,冲洗,干燥,每一种保护氨基酸4个重复,用凯氏定氮法测定剩余样品氮含量,以氮的消失率计算释放率。1.4试验结果分析所有数据经Excell处理后,采用SAS统计软件GLM程序对试验结果进行方差分析和Duncan’s多重比较,回归分析采用SAS统计软件REC过程进行。2结果与分析2.1下表同属性refindsoin标准体外法测定结果见表1。随着培养时间的延长,6种保护蛋氨酸在pH6.6缓冲液中的释放率增加,稳定性降低,其中产品M2稳定性最好,除培养48h与产品M5差异不显著外(P>0.05),其他时间点及与其他保护产品之间差异极显著(P<0.01);其次为产品M5,其在pH6.6缓冲溶液中培养4～48h的释放率极显著低于产品M1、M3、M4和M6(P<0.01)。表中同一列同一培养时间点肩标小写字母不同者差异显著(P<0.05),大写字母不同者差异极显著(P<0.01)。下表同Valuesinthesamecolumnandsameincubationtimewithdifferentsuperscriptssmalllettersaresignificantlydifferent(P<0.05);Valueswithdifferentcapitallettersareextremelydifferent(P<0.01).Thesameasbelow4种保护赖氨酸在pH6.6缓冲液中的释放率,随着培养时间的延长而提高,但释放率由高到低的顺序发生改变,培养4h时,产品L1极显著低于产品L2、L3和L4(P<0.01);培养8h时,产品L1和L3之间差异不显著(P>0.05),但产品L1和L3极显著低于产品L4和L2(P<0.01);培养24h时,产品L2和L4之间差异不显著(P>0.05),但产品L2和L4极显著低于L1和L3(P<0.01);培养48h时,产品L4极显著低于其它产品(P<0.01)。6种保护蛋氨酸和4种保护赖氨酸在pH2.4缓冲液中释放率的测定结果为:产品M1、M2、M3和M5的释放率均为100%,极显著高于产品M4和M6,产品M4在pH2.4缓冲液中培养4、8、24和48h的释放率分别为81.40%、81.40%、82.03%、100.00%;产品M6相应的释放率分别为:73.56%、76.61%、77.20%、100.00%;培养4～24h,产品M4的释放率极显著高于产品M6(P<0.01)。保护赖氨酸产品的释放率均为100%。2.2保护氨基酸产品在真胃和尼龙袋法中的释放率保护蛋氨酸和赖氨酸在瘤胃中的释放率测定结果见表2,蛋氨酸和赖氨酸在瘤胃中培养4～48h的释放率均为100%,与其他保护产品存在极显著差异(P<0.01),说明6种保护蛋氨酸产品和4种保护赖氨酸产品对于减少蛋氨酸和赖氨酸的释放均有一定效果。M5在瘤胃培养4～8h,其释放率与M2差异不显著,但极显著低于其它产品(P<0.01);培养24～48h,释放率极显著低于除M1以外的其它产品(P<0.01),与M1差异不显著(P>0.05)。保护赖氨酸产品中,L3在瘤胃中培养4h的释放率与L4差异不显著(P>0.05),但极显著低于L1和L2(P<0.01);瘤胃中培养8h,L3的释放率极显著低于L1和L4(P<0.01);瘤胃中培养24～48h,L3极显著低于L1(P<0.01)。综合评价6种保护蛋氨酸产品和4种保护赖氨酸产品,M5和L3产品在瘤胃中的稳定性最好。移动尼龙袋法测定保护蛋氨酸和赖氨酸在真胃及小肠的释放率结果见表3,6种保护蛋氨酸产品在真胃及小肠的释放率为97.67%～100%,产品之间差异不显著(P>0.05),4种过瘤胃保护赖氨酸产品释放率均为100%。对产品M5和L3的体外和尼龙袋法的测定结果进行回归分析,以Y代表尼龙袋法测定出的M5和L3产品在瘤胃的释放率,以X代表2种产品在pH6.6缓冲液中的释放率,结果表明,二者回归关系极显著(P<0.01),M5和L3的回归方程分别为:YM=-3.3876+1.2283XM和YL=1.8111+0.9499XL;相关系数分别为:RM2=0.8675和RL2=0.9630。3瘤胃保护氨基酸体外法和尼龙袋法的比较直接补充蛋氨酸和赖氨酸会在瘤胃迅速降解,蛋氨酸在瘤胃的降解率为78%,赖氨酸在瘤胃的降解率为76%～90%,而本研究证明蛋氨酸和赖氨酸在瘤胃培养4h的降解率为100%,Robinson等报道,奶牛补充L-lysine·HCl,其在瘤胃的降解率为96.5%,与本试验结果相近(100%)。由此可知蛋氨酸和赖氨酸在瘤胃具有高的降解率,对蛋氨酸和赖氨酸进行保护是减少其降解的一个有效途径。通过体外法测定结果表明,6种产品中用丙烯酸树脂Ⅳ号和乙基纤维素包被的M2及用氢化植物油和丙烯酸树脂Ⅳ号包被的M5在pH6.6缓冲液中释放率最低,在pH2.4缓冲液中释放率均为100%。6种产品的尼龙袋法测定结果表明,M5在瘤胃中培养0～48h的释放率最低,Rossi等研究证明用pH敏感聚合体包被的蛋氨酸在瘤胃的释放率低于用脂肪酸钙和氢化脂肪酸包被的蛋氨酸,本试验中用pH敏感聚合体以及用氢化植物油包被的蛋氨酸在瘤胃的释放率高于二者混合包被的蛋氨酸,这可能与保护方法有关;Robert等报道,pH敏感聚合体包被的蛋氨酸在增加血液氨基酸浓度方面优于用乙基纤维素包被的蛋氨酸,本试验结果也表明用丙烯酸树脂Ⅳ号包被的蛋氨酸在瘤胃释放率低于用乙基纤维素包被的蛋氨酸,也低于用丙烯酸树脂Ⅳ号和氢化植物油包被的蛋氨酸。有试验证明丙烯酸树脂Ⅳ号包被蛋氨酸在小肠的释放率为60.9%,用乙基纤维素包被的蛋氨酸为81.7%,本试验用丙烯酸树脂Ⅳ号保护的蛋氨酸在小肠的释放率为97.67%,而乙基纤维素保护的蛋氨酸为100%。据张树金的资料,将瘤胃保护蛋氨酸在瘤胃培育3～96h,瘤胃内蛋氨酸平均消失量分别为6%～87%,此保护蛋氨酸产品在瘤胃的稳定性高于本试验用瘤胃保护蛋氨酸产品。保护赖氨酸体外法试验结果表明,4种产品在不同缓冲液中的释放率没有明显的规律,这可能与赖氨酸的高溶解性有关,但尼龙袋法测定结果表明,L3在瘤胃培养不同时间的释放率均最低,其原因有待于进一步研究。研究证明,蛋氨酸在瘤胃内和体外的降解率是不同的,在瘤胃内的降解率是体外降解率的1.5倍,但两者存在显著的线性相关,说明体内、外的降解途径是一致的,与本试验结果相似。Rossi等试验结果表明,体外法和尼龙袋