活血祛痰方对糖尿病肾病大鼠肾脏gf-、smad7表达的影响

活血祛痰方对糖尿病肾病大鼠肾脏gf-、smad7表达的影响

糖尿病性肾衰竭是糖尿病最重要的微血管并发症之一，具体的发病机制尚不清楚。多数研究认为是以高血糖为启动因素所诱导的各种血管活性物质、生长因子、细胞介质等综合作用所致,其中转化生长因子-β(TGF-β)是导致肾脏纤维化的重要介质,Smad表达失衡是肾纤维化的分子基础。2013年1—10月,本研究观察活血祛痰方对糖尿病肾病大鼠模型TGF-β、Smad7表达的影响,并探讨其作用机制,为中医药防治糖尿病肾病提供理论依据。1材料和方法1.1实验动物及资料健康SPF级雄性SD大鼠(周龄4~6周)24只,体重180~200g,由广东省医学实验动物中心提供,许可证号SCXK粤2003-002,粤监证字2005A010。大鼠饲料为广东省医学实验动物中心提供的辐射育成料。1.2水树立剂mg/ml法活血祛痰方由丹参和法夏按15g∶10g水煮浓缩为250mg/mL制备而成(每1mL水煎剂相当于250mg混合生药),原药由广州中医药大学第一附属医院中药房提供;链脲佐菌素,批号:SO130,Sigma公司提供。1.3仪器、设备与测试荧光定量PCR仪(美国ABI公司)、分光光度计(美国Thermo公司)、全自动数码凝胶图像分析系统(上海圣科仪器设备有限公司)、正置显微镜及显像系统(德国Leica公司)、微孔板快速振荡器QL-9001(其林贝尔仪器制造有限公司)等。RT-PCR试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司]、水合氯醛、TRIzolReage、乙二胺四乙酸、SDS凝胶配制试剂盒、RIPA裂解液(强)、BCA蛋白浓度测定试剂盒等。1.4各组模型的制作将24只SD大鼠随机分为正常组、模型组和中药组,每组8只。模型组和中药组采用40mg/kg的链脲佐菌素溶液2次腹腔注射复制糖尿病肾病模型,以72h后连续3次检测血糖>16.6mmol/L、尿糖强阳性、24h尿蛋白排泄量>30mg为模型复制成功;正常组未进行链脲佐菌素诱导。造模成功后,中药组每只每天灌胃5mL复方中药液,分2次灌服,2.5mL/次;正常组、模型组均灌服等量生理盐水。1.5肾组织病理变化检测3组大鼠分别于给药30d后处死取材,处死前1d代谢笼收集24h尿液,并于第2天用10%水合氯醛(35mg/kg)肌肉注射麻醉,股动脉采血2mL,全自动生化分析仪检测24h尿蛋白定量(化学比浊法)、血白蛋白(Alb)、血肌酐(Cr)、血糖(Glu),0.9%NaCl溶液心脏灌后处死,切除肾脏,取少量肾组织常规制片,HE及PAS染色,光镜放大200倍观察肾组织病理变化。1.6引物的设计与合成采用Trizol一步法从各组肾脏中进行总RNA提取;采用一步法定量RT-PCR试剂盒进行TGF-β、Smad7PCR扩增,引物从GeneBank中查阅,根据引物设计原则,利用PrimerExpress2.0软件设计,所有引物均由上海基康生物技术有限公司合成;反应后取8μLPCR扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳,用计算机处理图象进行光密度扫描,以β-actin产物吸光度为参照,TGF-β、Smad7相对含量用其PCR产物吸光度与β-actin产物吸光度的比值表示。1.7统计方法2结果2.1alb及alrb水平灌胃30d后,与正常组比较,模型组24h尿蛋白定量、Cr、Glu水平均明显升高(P<0.01),Alb水平明显下降(P<0.05);与模型组比较,中药组24h尿蛋白定量、Cr、Glu水平均明显下降(P<0.05,P<0.01),Alb水平明显升高(P<0.05)。见表1。2.2小鼠肝肾组织病理学检测灌胃30d后,正常组肾小球结构及体积正常,肾小球系膜细胞及基质正常无增生;模型组肾小球体积明显增大,系膜增生明显,系膜细胞增多,肾小管上皮细胞肿胀;中药组肾小球略显肥大,但体积明显较模型组减少,系膜增生明显减轻,系膜细胞无明显增多,肾小管上皮细胞肿胀减轻。见图1。2.3中药组及模型组smad7的表达量比较灌胃30d后,模型组TGF-β的表达量较正常组明显升高(P<0.01),中药组TGF-β的表达量较模型组明显下降(P<0.01);模型组Smad7的表达量较正常组明显下降(P<0.01),中药组Smad7的表达量较模型组明显升高(P<0.01)。见表2和图2、3。3糖尿病肾病中smad7的表达糖尿病肾病是糖尿病的主要慢性并发症之一,也是导致终末期肾病的重要病因之一,其发病主要与炎症介质、氧化应激及糖代谢障碍等有关。大量研究表明TGF-β高表达是导致肾脏纤维化形成的重要分子机制,TGF-β不仅促进细胞外基质的合成和沉积,还可激活金属蛋白酶组织抑制因子来抑制金属蛋白酶的降解,进而加速肾小球硬化。Smad活性升高是肾脏纤维化发生的分子基础,有关实验研究表明TGF-β是在与其受体Tβ-R结合后,经磷酸化激活丝/苏氨酸激酶受体信号转导分子Smad、Smad2、Smad3与Smad4形成异聚体转移至核内,并在核内相关因子的辅助作用下影响一系列调节细胞外基质代谢的相关基因,从而促进器官纤维化。Smad7是Smad2、Smad3和Smad4三聚体的抑制因子,可多环节阻断TGF-β信号通路起到抗纤维化的作用。中医认为糖尿病肾病是消渴日久不愈,瘀血痰浊互结阻于肾络所致,痰和瘀是疾病发展的重要致病因素,文献复习整理发现糖尿病肾病的证型以血瘀、痰瘀为主。《素问·奇病论篇》曰:“此肥美之所发也,此人必数食甘美而多肥也,肥者令人内热,甘者令人中满,故其气上溢转为消渴,治之以兰,除陈气也。”说明过食肥甘损伤脾胃,痰浊内生伤津耗液,机体失去濡养而发为消渴;《临证指南医案·三消》:“三消之证,虽有上中下之分,其实不越阴亏阳亢,津枯血竭,致血液循环受阻而成血瘀。”相关研究报道,糖尿病肾病患者几乎100%存在瘀血的病理状态,瘀是构成糖尿病肾病肾小球硬化的病理基础。辨证施治是中医理论的核心,故活血化痰法是中医治疗糖尿病肾病的重要方法,同时我们前期实验研究提示,化痰祛瘀中药能减轻大鼠的腹膜纤维化程度。因此,本实验选用中药丹参和法夏,其中,丹参味苦寒降泻,为活血化瘀之要药,法半夏辛温而燥为燥湿化痰之要药,两者相伍,共奏活血祛痰之功,能切中糖尿病肾病的病机,起到延缓糖尿病肾病的功效。本研究结果显示,活血化痰方可减轻糖尿病肾病大鼠的临床症状和实验室指标,中药组大鼠24h尿蛋白定量、Cr和Glu水平明显低于模型组,Alb水平明显高于模型组,同时肾脏病理切片亦显示中药组大鼠肾脏损伤轻于模型组,