灯盏花素与ly333531对糖尿病大鼠肾脏的保护作用

灯盏花素与ly333531对糖尿病大鼠肾脏的保护作用

通过临床和实验研究，发现应用添加剂和蛋白激酶c（pdc）抑制剂可以缓解糖尿病肾病（dn）的进展。灯盏花素(breviscapine)是从菊科飞蓬属植物短亭飞蓬全草灯盏细辛中提取出的一类黄酮类成分,其药理作用有较强抗氧化、抑制PKC活性作用,已初步发现其能降低蛋白尿、改善肾小球结构异常。本研究以PKC抑制剂LY333531为对照探讨灯盏花素对大鼠糖尿病模型肾脏保护作用机制,旨在为灯盏花素应用于DN的干预提供实验依据。材料和方法一、糖尿病模型建立方法40只昆明种雄性SD大鼠(体重180～200g,本大学动物中心提供)在接受右侧肾切除术2周后随机分为对照组(C)、模型组(M)、灯盏花素组(M+B)与LY333531组(M+L),每组10只。糖尿病模型建立采用腹腔一次性注射链脲佐菌素(STZ,Sigma公司)60mg/kg方法。用药方案:LY333531(美国礼来公司)10mg·kg-1·d-1,灌胃给药;灯盏花素(含黄酮4.5mg/20mg,云南玉溪药业有限公司)20mg·kg-1·d-1,灌胃给药;对照组、模型组给予等量溶媒。所有大鼠在整个实验期间均喂标准饮食,自由饮水,不应用胰岛素,整个实验观察8周。二、肾组织pas染色大鼠处死前2d进代谢笼,收集24h尿,保存在-70℃冰箱中待测尿白蛋白及丙二醛(MDA)含量。右侧颈总动脉插管收集血标本测血糖水平。肾脏通过4℃预冷的生理盐水反复灌洗,颜色苍白后游离,取8mm3大小肾组织置于10%中性甲醛溶液中固定,石蜡包埋,3μm切片行PAS染色,4μm多聚赖氨酸处理切片行免疫组化。剩余肾组织切成小块,置于液氮中,冻透后转入-70℃冰箱中待测肾组织MDA含量及超氧化物岐化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱苷肽过氧化物酶(GSH-PX)与PKC活性。三、肾组织细胞am活性测定采用EIA法,严格按照试剂盒(法国SPI公司)说明书操作。高倍镜下随机选择30个肾小球,采用真彩色病理图像分析系统软件(北京航空航天大学)测定肾小球平均面积(AG)、肾小球平均容量(VG)及肾小球系膜区面积(AM)。MDA含量测定采用硫代巴比妥酸法,SOD活性采用联苯三酚自氧化法,CAT活性采用紫外速率测定法,GSH-PX活性采用NADPH耦联法,严格按照试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书操作。肾组织细胞膜和细胞浆分离采用超速离心法。蛋白定量采用考马斯亮蓝法。PKC活性采用放射活性测定法,严格按照试剂盒(美国Calbiochem公司)说明书操作,酶的活性单位为pmol·mg-1·min-1。胞浆PKC(PKCc)及胞膜PKC(PKCm)活性均以所测的实际活性与对照组所得的活性之差表示,细胞PKC总活性(PKCt)为胞浆及胞膜PKC活性之和。5.免疫总抗体tgf-1、ss法石蜡切片常规脱蜡,用3%H2o2甲醇封闭内源性过氧化酶,TGF-β1予微波炉暴露抗原,结缔组织生长因子(CTGF)予胰蛋白酶消化暴露抗原。1:10正常羊血清或兔血清及10%小牛血清白蛋白充分封闭非特异性抗原。加兔抗大鼠TGF-β1多单克隆抗体(1:100)或小鼠抗大鼠CTGF单克隆抗体(美国SantaCruza,1:50),4℃过夜。再加生物素化相应二抗(武汉博士德公司,1:200)室温30min,滴加链酶亲和素-生物素复合物(SABC,武汉博士德公司)室温30min,滴加DAB(北京中山公司)显色液,镜下控制着色时间。苏木素复染,常规脱水、透明、封片。实验采用删除第一抗体作阴性对照。阳性物质呈棕色颗粒状,同样应用上述图像分析软件计算阳性指数(PI):[阳性信号面积×平均阳性强度(平均灰度值)]/肾小球面积,取平均值。四、统计处理数据以表示,应用SPSS10.0软件包进行统计分析,采用One-WayANOVA检验。结果一、血糖、体重变化与对照组比,模型组血糖明显升高(P<0.01)、体重明显降低(P<0.01);两给药组血糖与模型组无明显差异,LY333531组体重明显高于模型组(P<0.05)。模型组肾重、肾重/体重及AER明显高于对照组(P<0.05,P<0.01),两给药组这些指标明显低于模型组(P<0.05)。见表1。二、vg与am检测PAS染色光镜下,图象分析显示模型组AG、VG与AM明显高于对照组(P<0.05,P<0.01);两给药组AG、VG与AM明显低于模型组(P<0.05),见表2,图1。三、肾组织及尿mda,sod、cat及gsh-px活性模型组肾组织及尿MDA含量明显高于对照组(P<0.01),肾组织SOD、CAT及GSH-PX活性明显低于对照组(P<0.05,P<0.01);两给药组肾组织及尿MDA含量明显低于模型组(P<0.05),SOD、CAT及GSH-PX活性明显高于模型组(P<0.05)。另外,灯盏花素组肾组织及尿MDA含量明显低于LY333531组(P<0.05),GSH-PX活性明显高于LY333531组(P<0.05)。见表3。四、kcm活性及pkcm/pkcc显著的比较模型组肾组织PKCt活性、PKCc活性、PKCm活性及PKCm/PKCc明显高于对照组(P<0.05,P<0.01);两给药组上述指标明显低于模型组(P<0.05),见表4。五、对肝肾-间质的影响TGF-β1与CTGF在对照组肾小球有少量表达;在模型组表达明显增加,除表达于肾小球外,肾小管-间质也有少量表达;在两给药组表达明显减少。免疫组化半定量分析显示,模型组TGF-β1、CTGF与PI值明显高于对照组(P<0.01);两给药组PI值明显低于模型组(P<0.05)。见表5,图2,图3。灯盏花素及其产物研究揭示DN的发病在代谢紊乱与血流动力学机制基础上,主要以氧化应激增加产生的氧反应产物(reactiveoxygenspecies,ROS)、PKC激活为上游信号分子所诱导的各种细胞介质、生长因子等综合作用结果。但单纯抗氧化、抑制PKC活性仅能部分减轻白蛋白尿、改善肾小球结构异常。近期,研究发现ROS与PKC激活既能各自通过细胞内信号转导诱导损伤介质致肾脏损害,又能相互激发、活化使肾脏损害加重。PKCN末端调节亚单位含锌结合、富半胱氨酸基序,可为过氧化物氧化激活,过氧化氢可通过酪氨酸激酶直接激活PKC。糖尿病环境中,高糖、糖基化蛋白、多元醇通路及游离脂肪酸除自身氧化产生ROS外,可通过NADPH氧化酶途径产生ROS,肾内该酶为PKC依赖性激活。选择一种既有抗氧化作用,又能抑制PKC活性的药物可能具有更强的肾脏保护作用。灯盏花素分子中含有还原性酚羟基,既可非竞争性抑制PKC活性,又可直接清除羟氧自由基、过氧自由基和淬灭单线态氧,抑制脂质过氧化,还可通过提高抗氧化酶系统活性等产生间接的抗自由基作用。蒋涛等证实灯盏花素可抑制高糖所诱导的c-fos、c-jun蛋白表达与Ⅳ型胶原合成增加。李英等报道灯盏花素可降低STZ诱导的糖尿病模型蛋白尿、改善肾小球结构异常,并可明显抑制肾内PKC转移激活。初步的研究表明灯盏花素对DN有一定的治疗作用,其对糖尿病模型肾内氧化应激的影响尚未见文献报道。我们的研究表明灯盏花素给药8周可明显减轻糖尿病大鼠AER的增加与肾脏肥大,与文献报道一致。糖尿病模型组肾组织和尿中MDA明显增加,抗氧化酶SOD、CAT、GSH-PX等活性明显降低,灯盏花素组肾组织与尿MDA含量明显降低,抗氧化酶得到部分恢复,其中GSH-PX活性接近对照组水平。尽管另一种PKC抑制剂LY333531也有部分抗氧化应激作用,但本研究结果显示灯盏花素对糖尿病肾组织氧化应激增加具有更强的抑制作用。本组同样证实灯盏花素与LY333531一样可明显抑制糖尿病肾组织PKC活性的增加。近年研究表明ROS与PKC激活可通过p38有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)、Janus激酶/信号转导与转录激活剂(JAK/STAT)途径诱导核转录因子κB(NF-κB)和激活蛋白-1(AP-1)基因转录,上调TGFβ1表达,通过其下游反应介质CTGF介导使细胞外基质(ECM)合成增加,肾小球硬化加速,促进DN发展。据报道LY333531可抑制高糖培养的肾小球系膜细胞与糖尿病模型肾内TGF-β1表达,灯盏花素对糖尿病肾内TGF-β1与CTGF表达的影响尚未见文献报道。本研究免疫组化结果表明,两给药组肾小球TGF-β1与CTGF表达程度较模型组明显减轻。由于TGF-β1除致ECM积聚外,同时具有抗炎症、抗增殖等作用,如长期阻断TGF-β