第十章核技术在生物技术中的应用

核技术在生物技术中的应用

第一节

核技术在核酸分子杂交中的应用一、核酸分子杂交的一般原理

核酸分子杂交技术：

具一定同源性的两条(DNA或RNA)单链在适宜的温度及离子强度等条件下,可按碱基互补配对原则特异性地复性，形成双链。探针(已知核酸片断，单链)待测核苷酸序列(单链)

核酸分子杂交技术，是在1968年由华盛顿卡内基学院（CarnegieInstituteofWashington）的RoyBritten及其同事发明的。所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。

一、核酸分子杂交的一般原理

一、核酸分子杂交的一般原理

DNA变性方法热变性：90~100℃酸碱变性：常采用碱变性化学试剂变性：尿素、甲酰胺、甲醛等特点：粘度增加、密度增加、增色效应、溶解温度(meltingtemperature,Tm)DNA复性或杂交(hybridization)DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等二、核酸分子杂交的基本类型

Southern印迹法Northern印迹法Western印迹法原位杂交斑点印迹杂交液相杂交SouthernDNA印迹杂交

使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。由于它是由英国人EdwinMellorSouthern于1975年首先设计出来的，故又叫Southernblot。二、核酸分子杂交的基本类型

二、核酸分子杂交的基本类型

Southern杂交的主要步骤待测DNA样品的制备、酶切待测DNA样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳凝胶中DNA的变性：碱变性Southern转膜：硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法探针的制备

Southern杂交杂交结果的检测（a）（b）（c）（d）（e）基因组DNADNA限制片段硝酸纤维素滤膜同探针同源杂交的基因DNA片段X光底片二、核酸分子杂交的基本类型

DNA凝胶电泳SouthernDNA印迹杂交之X光显像图片水稻（OryzasativaL.)的叶绿体DNA分别用核酸内切限制酶BglⅡ(A-C)、BamHⅠ（D-F）、EcoRⅠ（G-I）、和HindⅢ（J-L）消化，加样在含有EtBr染料的1%的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同32P标记的玉米psbA探针作Southern杂交。X光底片中显现的阳性条带，表明含有水稻的psbA基因序列二、核酸分子杂交的基本类型

Northern杂交*1979年，J.C.Alwine等人发展而来，是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。也称为Northern印迹（NorthernBlot），用以检测某一特定的RNA（通常是mRNA）片段的存在及表达量。*因这种方法与Southernblot杂交技术十分类似，与DNA的杂交（Southern杂交）相对应，被趣称为Northern杂交。二、核酸分子杂交的基本类型

Northern印迹杂交

1、基本原理和基本过程与Southernblot基本相同

2、鉴别RNA3、探针可用DNA或RNA片段

4、待测样品为总RNA或mRNANorthern印迹与Southern印迹的不同点

1、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保持RNA处于变性状态，DNA电泳前和电泳中不变性与Southern印迹杂交不同之处：

RNA电泳避免单链RNA自身形成高级结构和自身降解

变性凝胶电泳(甲醛、尿素、甲酰胺等)RNase抑制环境二、核酸分子杂交的基本类型

2、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理,Southern印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理

3、靶核酸为RNA二、核酸分子杂交的基本类型

斑点及狭缝印迹杂交

1、斑点印迹为圆形

2、狭缝印迹为线状

3、鉴别DNA、RNA4、简单、快速，同一张膜可检测多个样品

5、特异性不高、不能鉴别核酸分子量二、核酸分子杂交的基本类型

斑点印迹杂交(dotbloting)将RNA或DNA变性后直接点样于NC膜或尼龙膜上优点：简单、快速、可同时检测多个样品二、核酸分子杂交的基本类型

原位杂交(insituhybridization)*细胞或染色体的原位杂交，用于基因定位。

*细菌菌落的原位杂交：筛选阳性克隆。将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行杂交，称原位杂交。根据检测物分细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据探针与待检核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA杂交。特点能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态二、核酸分子杂交的基本类型

原位杂交

1、定义：将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行杂交，称原位杂交。根据检测物分细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据探针与待检核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA杂交二、核酸分子杂交的基本类型

保持组织细胞的形态对核酸无抽提，修饰与降解作用不改变核酸在组织细胞内的定位不阻碍核酸与探针的杂交过程对杂交信号无遮蔽作用理化性质稳定2、杂交过程：（1）组织或细胞的固定理想固定液应具备：二、核酸分子杂交的基本类型

（2）组织细胞杂交前的预处理

去垢剂（如Tritonx-100和SDS）和蛋白酶

K去除核酸表面的蛋白质组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体控制消化时间，避免细胞结构破坏和核酸从载玻片上脱落二、核酸分子杂交的基本类型

（3）探针的选择与标记

以获得最好杂交效果为依据选择探针探针的长度一般为50~300bp,有时达1.5kb

放射性核素标记探针敏感性高，操作简便稳定检测结果分辨率高，但信号检测时间长非核素标记探针安全、稳定性好、显色快，易于观察二、核酸分子杂交的基本类型

（4）杂交

杂交液体积小：10~20μlcDNA和RNA探针杂交温度约为50℃

杂交时间:DNA探针杂交为2~4h.RNA探针杂交过夜杂交前一般将组织切片置95℃5~15分钟使DNA变性冲洗温度一般不超过50℃（5）杂交结果检测

所用探针为核素标记,放射自显影检测所用探针为非核素标记,比色或化学发光检测

核技术在生物技术中的应用

第二节

核酸探针的放射性核素标记核酸杂交的探针

(1)常用探针类型：

①人工合成寡核苷酸探针②基因组DNA探针③cDNA探针④RNA探针

(2)探针标记物①放射性标记物

32P高放射性半衰期14.3d

35S放射性较弱半衰期87.1d

3H放射性弱半衰期12.35a

②非放射性标记物

半抗原：生物素、地高率配体：生物素是亲和素的配体荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明等化学发光探针：标记物与某种底物反应发光，如生物素酰化的碱性磷酸酶可使发光底物发光

(2)探针标记物理想标记物应具备的特性：

高度灵敏性不影响碱基配对的特异性不影响探针分子的主要理化性质对酶促反应活性无影响或影响不大检测方法具有高度灵敏性和高度特异性(3)探针标记方法

切口平移法(nicktranslation)随机引物法(randomprimer)：六核苷酸残基的引物PCR标记法末端标记法1、利用DNaseI在DNA双链上造成单链切口2、利用大肠杆菌DNA聚合酶I的53核酸外切酶活性在切口处将旧链从5

末端逐步切除3、在DNA聚合酶I的53聚合酶催化下，以互补的DNA单链为模板依次将dNTP连接到切口的3末端-OH上，合成新的DNA链，同时将标记的核苷酸掺入到新的DNA链中1、切口平移法（nicktranslation)①切口平移法(nicktranslationlabeling)5’5’3’3’3’3’3’5’5’5’5’5’5’3’3’3’3’5’5’5’5’5’5’3’DNA酶IDNA聚合酶I+标记的dNTP5’3’变性探针平均长度600bp2、随机引物法

其原理是随机引物能与各种单链DNA模板结合，作为合成新链的引物，在DNA聚合酶的催化下，按53方向合成一新的DNA链，其核苷酸序列与模板DNA完全互补。另一单链DNA模板同样合成一条新的完全互补的DNA链。合成时，带放射性核素标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中随机引物法所具有的优点：1、能进行双链DNA、单链DNA或RNA探针的标记2、操作简单方便，避免因DNaseI处理浓度掌握不当所带来的一系列问题3、标记活性高，标记活性可达108cpm/µgDNA以上4、可直接在低熔点琼脂糖溶液中进行标记②随机引物法(randomprimedDNAlabeling)5’3’5’3’5’3’5’3’随机6-12bp单核苷酸引物变性一般探针长度在400-600bp之间3、单链DNA探针

用双链探针杂交检测另一个远缘DNA时,探针序列与被检测序列间有很多错配.而两条探针互补链之间的配对却十分稳定,即形成自身的无效杂交,结果使检测效率下降.采用单链探针则可解决这一问题.单链DNA探针的合成方法主要有下列两种:

(1)以M13载体衍生序列为模板,用Klenow片段合成单链探针;

(2)以RNA为模板,用反转录酶合成单链cDNA探针.

从M13载体衍生序列合成单链DNA探针：

合成单链DNA探针可将模板序列克隆到噬粒或M13噬菌体载体中,以此为模板,以特定的通用引物或以人工合成的寡合苷酸为引物,在[a-32P]-dNTP的存在下,由Klenow片段作用合成放射标记探针,反应完毕后得到部分双链分子.在克隆序列内或下游用限制性内切酶切割这些长短不一的产物,然后通过变性凝胶电泳(如变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)将探针与模板分离开.双链RF型M13DNA也可用于单链DNA的制备,选用适当的引物即可制备正链或负链单链探针.材料：已制备好的单链DNA模板。

设备：高速台式离心机,恒温水浴锅等.

4、从RNA合成单链cDNA探针

cDNA单链探针主要用来分离cDNA文库中相应的基因.用RNA为模板合成cDNA探针所用的引物有两种:(1)用寡聚dT为引物合成cDNA探针.本方法只能用于带Poly(A)的mRNA,并且产生的探针极大多数偏向于mRNA3'末端序列.(2)可用随机引物合成cDNA探针.该法可避免上述缺点,产生比活性较高的探针.但由于模板RNA中通常含有多种不同的RNA分子,所得探针的序列往往比以克隆DNA为模板所得的探针复杂得多,应预先尽量富集mRNA中的目的序列.

反转录得到的产物RNA/DNA杂交双链经碱变性后,RNA单链可被迅速地降解成小片段,经SephadexG-50柱层析即可得到单链探针.

5、末端标记法(terminallabeling)3’末端

5’末端[注意]

1、利用本方法可对DNA分子量标准进行标记,利用它可定位因片段太小而无法在凝胶中观察的DNA片段.

2、对DNA的纯度不很严格,少量制备的质粒也可进行末端标记合成探针.

3、末端标记还有其他的一些方法,如利用T4多核苷酸激酶标记脱磷的5'端突出的DNA和平末端凹缺DNA分子,也可利用该酶进行交换反应标记5'末端.

6、寡核苷酸探针

利用寡核苷酸探针可检测到靶基因上单个核苷酸的点突变.常用的寡核苷酸探针主要有两种:单一已知序列的寡核苷酸探针和许多简并性寡核苷酸探针组成的寡核苷酸探针库.单一已知序列寡核苷酸探针能与它们的目的序列准确配对,可以准确地设计杂交条件,以保证探针只与目的序列杂交而不与序列相近的非完全配对序列杂交,对于一些未知序列的目的片段则无效.

核技术在生物技术中的应用

第三节

放射性核素在基因检测中的应用Maxam-Gilbert化学降解法

化学降解法：人们用专一性作用于A、T、G、C碱基的化学药剂分别处理经内切酶切割而成的一定长度DNA片段，通过控制反应时间，既可获得分别以A、T、G、C为结尾的四组由所有可能长度核苷酸片段组成的DNA片段群。除了要研究与DNA的高级结构、DNA-蛋白质结构相关性采用化学降解法外，对于单纯以测序为目的的实验，普遍采用后面所讲的酶促合成法。

Sanger链终止法1977年Sanger设计了一种通过DNA复制来识别4种碱基的方法，进行DNA序列测定，即双脱氧链终止法。Sanger法获得诺贝尔化学奖。一、Sanger双脱氧链终止法原理在模板指导下，DNA聚合酶不断将dNTP加到引物的3’-OH末端，使引物延长，合成出新的互补的DNA链，如果加入双脱氧三磷酸核苷(ddNTP)，由于双脱氧核糖的3’位置上缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，即形成一种全部具有相同5’-引物端和以ddNMP残基为3’端结尾的一系列长短不一片段的混合物。由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链DNA，从而读取DNA核苷酸序列。

二、双脱氧终止法测序反应体系：DNA聚合酶单链DNA模板带有3-OH末端的单链寡核苷酸引物Mg2+4种dNTP(aATP、dGTP、dCTP和dTTP)4种ddNTP(ddATP、ddGTP、ddCTP和ddTTP)测序过程:1.模板与引物杂交2.引物的延长和合成阻断四个试管分别加入：DNA聚合酶、dNTPs、标记引物终止剂不同：ddA、ddG、ddC、ddT四个试管中所有产物是一系列长度只差一个核苷酸的聚合链3.电泳：ACGT次序，高压电泳4.放射自显影得到直读图象外源基因表达研究中的应用1.外源基因的转录

启动子类型：组成型启动子原核生物T7启动子

诱导型启动子原核生物lac、trp等组织特异性表达启动子

2.mRNA的延伸与稳定性

原核生物避免序列存在衰减子(attenuator)

带有正常转录终止序列受体细胞情况

ABtrp衰减子带有正常转录终止序列

真核生物要带有转录终止序列与poly(A)

渗入位点

poly(A)渗入信号序列AAUAAA受体细胞情况原核生物最佳选择RNase缺失个体真核生物mRNA正确加工，提高稳定性3.外源基因mRNA的有效翻译原核生物

①AUG(ATG)首选起始密码子