第四章蛋白质的翻译

第四章生物信息传递:蛋白质翻译

(TranslationofProtein)本章讲授内容：

4.1遗传密码-----三联子

4.2tRNA的结构、功能及种类

4.3核糖体的结构及功能

4.4蛋白质合成的生物学机制

4.5蛋白质的运转机制基因的表达过程：蛋白质的生物合成是一个比DNA复制和转录更为复杂的过程

基本概念

翻译是指将mRNA链上的核苷酸从一个特定的起始位点开始，按每3个核苷酸代表一个氨基酸的原则，依次合成一条多肽链的过程。

核糖体是蛋白质合成的场所，mRNA是蛋白质合成的模板，tRNA是模板与氨基酸之间的接合体。此外，在合成的各个阶段还有许多蛋白质、酶和其他生物大分子参与。5贮存在DNA上的遗传信息通过mRNA传递到蛋白质上，mRNA与蛋白质之间的联系是通过遗传密码的破译来实现的。mRNA上每3个核苷酸翻译成蛋白质多肽链上的一个氨基酸，这3个核苷酸就称为密码，也叫三联子密码。4.1遗传密码—三联子翻译时从起始密码子AUG开始，沿着mRNA的5′→3′的方向连续阅读密码子，直至终止密码子为止，生成一条具有特定氨基酸序列的多肽链。新生的多肽链中氨基酸的组成和排列顺序决定于其DNA碱基组成及其顺序。因此，作为基因产物的蛋白质最终是受基因控制的。4.1.1

三联子密码及其破译遗传密码的破译—确定代表每种氨基酸的具体遗传密码。蛋白质的氨基酸序列是由mRNA的核苷酸序列决定的，所以，要知道它们之间的关系就要弄清核苷酸和氨基酸数目的对应关系。1954年科学家对破译密码首先提出了设想：A.若一种碱基对应与一种氨基酸，那么只可能产生4种氨基酸;B.若2个碱基编码一种氨基酸的话，4种碱基共有42=16种不同的排列组合;C.3个碱基编码一种氨基酸，经排列组合可产生43=64种不同形式;D.若是四联密码，就会产生44=256种排列组合。1.以均聚物、随机共聚物和特定序列的共聚物为模板指导多肽的合成制备大肠杆菌的无细胞合成体系:在含DNA、mRNA、tRNA、核糖体、AA-tRNA合成酶及其他酶类的抽提物中加入DNase，降解体系中的DNA，耗尽mRNA时体系中的蛋白质合成即停止，当补充外源mRNA或人工合成的各种均聚物或共聚物作为模板以及ATP、GTP、氨基酸等成分时又能合成新的肽链，新生肽链的氨基酸顺序由外加的模板所决定。因此，分析比较加入的模板和合成的肽链即可推知编码某些氨基酸的密码。9Tritiated-polyU,whenaddedtocell-freeextractsofEscherichiacoli,becameassociatedwithribosomes.Thisassociationoccurredat3degreesCanddidnotrequirehigh-energyphosphatecompounds.Smallamountsoftritiatedpolyuridylicacidproducedpolydisperseribosomalaggregateswithsedimentationconstantsofapproximately100to130.C(14)-phenylalanineinitiallywasincorporatedintoproteinonlyontheseparticles,whichsuggeststhattheyarethesitesofpolyphenylalaninesynthesis.NirenbergMW.

FateofaSyntheticPolynucleotideDirectingCell-FreeProteinSynthesisII.AssociationwithRibosomes.Science.1962,138(3542):813-817.1961,NirenbergMW.在无细胞体系中Mg2+浓度很高，人工合成的多聚核苷酸不需要起始密码子就能指导多肽的生物合成，读码起始是随机的。然而，在生理Mg2+条件下，没有起始密码子的多核苷酸不能被用作多肽合成的模板。以多聚三核苷酸作为模板可得到有3种氨基酸组成的多肽。如以多聚(UUC)为模板，可能有3种起读方式。

5’……UUCUUCUUCUUCUUC……3’

或5’……UCUUCUUCUUCUUCU……3’

或5’……CUUCUUCUUCUUCUU……3‘根据读码起点不同，产生的密码子可能是UUC(Phe)、UCU(Ser)或CUU(Leu)，所以得到的多肽可能是多聚苯丙氨酸、多聚丝氨酸或多聚亮氨酸，由此可知UUC、UCU、CUU分别是苯丙氨、丝氨酸及亮氨酸的密码子。以多聚三核苷酸为模板时也可能只合成2种均聚多肽，以多聚(GUA)n为例：

5’……GUAGUAGUAGUAGUA……3’

或5’……UAGUAGUAGUAGUAG……3’

或5’……AGUAGUAGUAGUAGU……3’

由第二种读码方式产生的密码子UAG是终止密码，不编码任何氨基酸，因此，只产生2种密码子GUA(Val)或AGU(Ser)，所以,合成的多肽要么是多聚缬氨酸，要么是多聚丝氨酸。2.核糖体结合技术1964年采用三联体结合实验发现：(1)tRNA和氨基酸及三联体的结合是特异的；(2)上述结合的复合体大分子是不能通过硝酸纤维滤膜的微孔，而tRNA-氨基酸的复合体是可以通过的。

(1)以人工合成的三核苷酸如UUU、UCU、UGU等为模板，在含核糖体、AA-tRNA的适当离子强度的反应液中保温，然后使反应液通过硝酸纤维素滤膜。(2)发现:

游离的AA-tRNA因相对分子质量小能自由通过滤膜，加入三核苷酸模板可以促使其对应的AA-tRNA结合到核糖体上，体积超过膜上的微孔而被滞留，这样就能把已结合到核糖体上的AA-tRNA与未结合的AA-tRNA分开。核糖体结合实验色氨酸-tRNA的分离用20种AA-tRNA做20组同样的实验，每组都含20种AA-tRNA和各种三核苷酸，但只有一种氨基酸用14C标记，看哪一种AA-tRNA被留在滤膜上，进一步分析这一组的模板是哪个三核苷酸，从模板三核苷酸与氨基酸的关系可测知该氨基酸的密码子。例如，模板是UUU时，Phe-tRNA结合于核糖体上，可知UUU是Phe的密码子。4.1.2遗传密码的性质1.密码的连续性

密码子是mRNA上连续排列的三个核苷酸序列，并编码一个氨基酸信息的遗传单位。翻译由mRNA的5’端的起始密码子开始，一个密码子按一个密码子连续地阅读直到3‘终止密码子，密码子间无间断也没有重叠，起始密码子决定了所有后续密码子的位置，说明三联子密码是连续的。172.密码的简并性按照1个密码子由3个核苷酸组成的原则，4种核苷酸可组成64个密码子，现在已经知道其中61个是编码氨基酸的密码子，另外，UAA、UGA和UAG等3个密码子并不代表任何氨基酸，它们是终止密码子，不能与tRNA的反密码子配对，但能被终止因子或释放因子识别，终止肽链的合成。因为存在61种密码子而只有20种氨基酸，所以许多氨基酸有多个密码子。实际上除色氨酸（UGG）和甲硫氨酸（AUG）只有一个密码子外，其他氨基酸都有一个以上的密码子，其中9种氨基酸有2个密码子，1种氨基酸有3个密码子，5种氨基酸有4个密码子，3种氨基酸有6个密码子。由一种以上密码子编码同一个氨基酸的现象称为简并，对应于同一氨基酸的多个密码子称为同义密码子（synonymouscodon）。另外，AUG和GUG既是甲硫氨酸及缬氨酸的密码子又是起始密码子，这种双重功能在生物学上的优点尚不清楚。同义密码子一般都不是随机分布的，因为其第一、第二位核苷酸往往是相同的，而第三位核苷酸的改变并不一定影响所编码的氨基酸，这种安排减少了变异对生物的影响。一般说来，编码某一氨基酸的密码子越多，该氨基酸在蛋白质中出现的频率也越高。3.

密码的通用性与特殊性遗传密码无论在体内还是体外，也无论是对病毒、细菌、动物还是植物而言都是通用的，所以，密码子具有通用性。已经查明，在支原体中，终止密码子UGA被用来编码色氨酸；在嗜热四膜虫中，另一个终止密码子UAA被用来编码谷氨酰胺。密码子具有特殊性。4.密码子与反密码子的相互作用在蛋白质生物合成过程中，tRNA的反密码子在核糖体内是通过碱基的反向配对与mRNA上的密码子相互作用的。1966年Crick根据立体化学原理提出摆动假说(wobblehypothesis)。摆动假说:在密码子与反密码子的配对中，前两对严格遵守碱基配对原则，第三对碱基有一定的自由度，可以“摆动”，因而使某些tRNA可以识别1个以上的密码子;如果有几个密码子同时编码一个氨基酸，凡是第一、二位碱基不同的密码子都对应于各自独立的tRNA。原核有30-45种tRNA，真核有50种tRNA。I：InosineisformedbydeaminationofadenosineaftertRNAsynthesis

4.2tRNA

tRNA在蛋白质合成中处于关键地位，它不但为每个三联密码子翻译成氨基酸提供了接合体，还为准确无误地将所需氨基酸运送到核糖体上提供了运送载体，所以，它又被称为第二遗传密码。tRNA参与多种反应，并与多种蛋白质和核酸相互识别，这就决定了它们在结构上存在大量的共性。各种tRNA均含有70~80个碱基，其中22个碱基是恒定的。具五臂四环结构:1.受体臂（acceptorarm）：主要由链两端序列碱基配对形成的杆状结构和3′端末配对的3-4个碱基所组成，其3′端的最后3′个碱基序列保守的CCA，最后一个碱基的3′或2′自由羟基可以被氨酰化。此臂负责携带特异的氨基酸。2.TψC臂:根据3个核苷酸命名的，其中ψ表示拟尿嘧啶，是tRNA分子所拥有的不常见核苷酸。常由5bp的茎和7Nt和环组成，负责与核糖体上的rRNA识别结合。4.2.1tRNA的结构1、tRNA的二级结构

3.反密码子臂(anticodonarm):位于套索中央的三联反密码子。常由5bp的茎区和7Nt的环区组成，它负责对密码子的识别与配对。4.D臂(Darm):含有二氢尿嘧啶，茎区长度常为4bp，也称双氢尿嘧啶环。负责和氨基酰-tRNA聚合酶结合。5.额外环(extraarm)：可变性大，4-21nt不等，其功能是在tRNA的L型三维结构中负责连接两个区域（D环－反密码子环和TψC-受体臂）。tRNA的稀有碱基含量非常丰富，约有70余种。每个tRNA分子至少含有2个稀有碱基，最多有19个，多数分布在非配对区。特别是在反密码子3′端邻近部位出现的频率最高，且大多为嘌呤核苷酸，这对于维持反密码子环的稳定性及密码子、反密码子之间的配对是很重要的。研究证实：tRNA的性质是由反密码子而不是它所携带的氨基酸所决定的，而除了起始tRNA外，所有tRNA都能被翻译辅助因子EF-Tu或eEF1所识别而与核糖体相结合，起始tRNA能被IF-2或eIF-2所识别。4.2.2．tRNA的功能转录过程是遗传信息从DNA转移至另一种结构上极为相似的核酸分子mRNA的过程，信息转移靠的是碱基配对。翻译阶段遗传信息从mRNA分子转移到结构极不相同的蛋白质分子，信息是以能被翻译成单个氨基酸的三联子密码形式存在的，在这里起作用的是解码机制。4.2.3tRNA的种类1、起始tRNA和延伸tRNA

能特异地识别mRNA模板上起始密码子的tRNA叫起始tRNA，其他tRNA统称为延伸tRNA。原核生物起始tRNA携带甲酰甲硫氨酸（fMet），真核生物起始tRNA携带甲硫氨酸（Met）。2、同工tRNA

代表同一种氨基酸的tRNA称为同工tRNA，同工tRNA既要有不同的反密码子以识别该氨基酸的各种同义密码，又要有某种结构上的共同性，能被AA-tRNA合成酶识别。3、校正tRNA

在结构基因中的一个核苷酸的改变可能使代表某个氨基酸的密码子变成终止密码子，使蛋白质合成提前终止，合成无功能的多肽，这种突变就称为无义突变，而校正tRNA经改变反密码子区可校正无义突变。（络氨酸）错义突变（missensemutation）由于结构基因中某个核苷酸的变化使一种氨基酸的密码变成另一种氨基酸的密码。错义突变的校正tRNA通过反密码子区的改变把正确的氨基酸加到肽链上，合成正常的蛋白质。校正tRNA在进行校正过程中必须与正常的tRNA竞争结合密码子。无义突变的校正tRNA必须与释放因子竞争识别密码子；错义突变的校正tRNA必须与该密码的正常tRNA竞争，都会影响校正的效率。校正基因的效率不仅决定于反密码子与密码子的亲和力，也决定于它在细胞中的浓度及竞争中的其他参数。一般说来，校正效率不会超过50%。

AA-tRNA合成酶是一类催化氨基酸与tRNA结合的特异性酶，其反应式如下：它实际上包括两步反应：第一步，氨基酸活化生成酶-氨基酰腺苷酸复合物：

AA+ATP+酶（E）→E-AA-AMP+PPi

第二步，氨酰基转移到tRNA3’末端腺苷残基上，与其2’或3’-羟基结合。E-AA-AMP+tRNA→AA-tRNA+E+AMP4.2.4氨酰-tRNA合成酶

核糖体像一个能沿mRNA模板移动的工厂，执行着蛋白质合成的功能。它是由几十种蛋白质和几种核糖体RNA组成的亚细胞颗粒。一个细菌细胞内约有2万个核糖体，而真核细胞内可达106个，在未成熟的蟾蜍卵细胞内则高达1012。核糖体和它的辅助因子为蛋白质合成提供了必要条件。

在生物细胞中，核糖体数量非常大。4.3核糖体4.3.1核糖体的结构2.核糖体的功能

核糖体有3个tRNA结合位点。A位：AA-tRNA的结合部位；P位：肽酰-tRNA的结合部位、肽基转移部位及形成肽键的部位；E位：肽链延伸过程中的多肽链转移到氨酰-tRNA上释放tRNA位点脱出。小亚基上拥有mRNA结合位点，负责对序列特异的识别过程，如起始位点的识别和密码子与反密码子的相互作用。大亚基负责氨基酸及tRNA携带的功能，如肽键的形成、AA-tRNA、肽基-tRNA的结合等。A位、P位、转肽酶中心等主要在大亚基上。表14-8核糖体的活性位点活性位点功能位置组分mRNA结合位点结合mRNA和IF因子30S,P位点附近S1、S18、S21；及S3、S4、S5、S12

16SrRNA3′末端区域P位点结合fMet-tRNA和肽基-tRNA大部分在50S亚基L2、L27及L14、L18、L24、L3316S和23SrRNA3′附近区域A位点结合氨酰基-tRNA大部分在30S亚基L1、L5、L7/L12、L20、L30、L3316S和23SrRNA（16S的1400区）E位点结合脱酰tRNA50S23SrRNA是重要的5SRNA和23SrRNA结合P和A位点的附近L5、L18、L25复合体肽酰基转移酶将肽链转移到氨基酰-tRNA上50S的中心突起L2、L3、L4、L15、L16

23SrRNA是重要的EF-Tu结合位点氨基酰-tRNA的进入30S外部EF-G结合位点移位50S亚基的界面上，L7/L12附近，近S12L7/L12GTP酶需要50S的柄L7、L124.4蛋白质生物合成的生物学机制研究证明：

核酸是生命体内最基本的物质，因为蛋白质的合成和结构最终都取决于核酸，但蛋白质仍是生物活性物质中最重要的大分子组分，生物有机体的遗传学特性仍然要通过蛋白质来得到表达。

蛋白质的生物合成包括氨基酸活化、肽链的起始、伸长、终止以及新合成多肽链的折叠和加工。蛋白质的生物合成是以氨基酸作为基本建筑材料的，且只有与tRNA相结合的氨基酸才能被准确地运送到核糖体中，参与多肽链的起始或延伸。氨基酸必须在氨酰-tRNA合成酶的作用下生成活化氨基酸——AA-tRNA。4.4.1氨基酸的活化研究发现:细胞至少存在20种以上具有氨基酸专一性的氨酰-tRNA合成酶，能够识别并通过氨基酸的-COOH与tRNA3‘端腺苷酸核糖基上3-OH缩水形成二酯键。同一个氨酰-tRNA合成酶具有把相同氨基酸加到两个或更多个带有不同反密码子tRNA分子上的功能。原核生物

起始氨基酸是甲酰甲硫氨酸，所以，与核糖体小亚基相结合的是N-甲酰甲硫氨酰-tRNAfMet，它由以下两步反应合成。

（1）Met+tRNAfMet+ATP→Met-tRNAfMet+AMP+PPi；

（2）甲酰基转移酶将1个甲酰基转移到Met的氨基上

N10-甲酰四氢叶酸+Met-tRNAfMet→四氢叶酸+fMet-tRNAfMet

。真核生物

任何一个多肽合成都是从生成甲硫氨酰-tRNAiMet开始的，因为甲硫氨酸的特殊性，所以，体内存在两种tRNAMet。只有甲硫氨酰-tRNAiMet才能与40S小亚基相结合，起始肽链合成，普通tRNAMet中携带的甲硫氨酸只能被掺入正在延伸的肽链中。IF-19.5kDa加强IF-2，IF-3的酶活IF-295kDa~117kDa促使fMet-tRNAfmet

选择性的结合在30S亚基上IF-320kDa促使30S亚基结合于mRNA起始部位具有解离30S与50S亚基的活性

4.4.2翻译的起始1、原核生物的翻译启始因子

原核生物翻译的起始：第一步：30S小亚基首先与翻译起始因子IF-1，IF-3结合，通过SD序列与mRNA模板结合;

第二步：在IF-2和GTP的帮助下，fMet-tRNAfMet进入小亚基的P位，tRNA上的反密码子与mRNA上的起始密码子配对;

第三步：带有tRNA，mRNA，三个翻译起始因子的小亚基复合物与50S大亚基结合，GTP水解，释放翻译起始因子。Initiationcodon30S小亚基具有专一性的识别和选择mRNA起始位点的性质，而IF-3能协助小亚基完成这种选择。研究发现：30S亚基通过其16SrRNA的3’末端与mRNA5’端起始密码子上游碱基配对结合。ShineandDalgarno等证明几乎所有原核生物mRNA上都有一个5’-AGGAGGU-3’序列，这个富嘌呤区与30S亚基上16SrRNA3’末端的富嘧啶区序列5’-GAUCACCUCCUUA-3’相互补.各种mRNA的核糖体结合位点中能与16SrRNA配对的核苷酸数目及这些核苷酸和起始密码子之间的距离是不一样的，反映了起始信号的不均一性。一般说来，相互补的核苷酸越多，30S亚基与mRNA起始位点结合的效率也越高。互补的核苷酸与AUG之间的距离也会影响mRNA-核糖体复合物的形成及其稳定性。真核生物蛋白质生物合成的起始机制与原核生物基本相同，其差异主要是核糖体较大，有较多的起始因子参与，其mRNA具有m7GpppNp帽子结构，Met-tRNAMet不甲酰化，mRNA分子5'端的“帽子”和3'端的多聚A都参与形成翻译起始复合物。细菌核糖体与氨酰-tRNA结合位点:A位点(氨酰基部位，Aminoacylsite)P位点(肽基部位，Peptidylsite)E位点(Exitsite)只有fMet-tRNAfMet能与第一个P位点相结合，其它所有tRNA都必须通过A位点到达P位点，再由E位点离开核糖体。

实验证明：

帽子结构能促进起始反应，因为核糖体上有专一位点或因子识别mRNA的帽子，使mRNA与核糖体结合。帽子在mRNA与40S亚基结合过程中还起稳定作用。实验表明：带帽子的mRNA5'端与18SrRNA的3'端序列之间存在不同于SD序列的碱基配对型相互作用。40S小亚基除了帽子结构以外，40S小亚基还能识别mRNA上的起始密码子AUG。Kozak等提出了一个“扫描模型”来解释40S亚基对mRNA起始密码子的识别作用。按照这个模型，40S小亚基先结合在mRNA5‘端的任何序列上，然后沿mRNA移动直至遇到AUG发生较为稳定的相互作用，最后与60S亚基一道生成80S起始复合物。40S小亚基之所以能在AUG处停下，可能是由于Met-tRNAiMet的反密码子与AUG配对的结果。

4.4.3肽链的延伸

生成起始复合物，第一个氨基酸（fMet/Met-tRNA）与核糖体结合以后，肽链开始伸长。按照mRNA模板密码子的排列，氨基酸通过新生肽键的方式被有序地结合上去。肽链延伸由许多循环组成，每加一个氨基酸就是一个循环，每个循环包括AA-tRNA与核糖体结合、肽键的生成和移位。

1、后续AA-tRNA与核糖体结合起始复合物形成以后，第二个AA-tRNA在延伸因子EF-Tu及GTP的作用下，生成AA-tRNA·EF-Tu·GTP复合物，然后结合到核糖体的A位上。这时GTP被水解释放，通过延伸因子EF-Ts再生GTP，形成EF-Tu·GTP复合物，进入新一轮循环。模板上的密码子决定了哪种AA-tRNA能被结合到A位上。由于EF-Tu只能与fMet-tRNA以外的其他AA-tRNA起反应，所以起始tRNA不会被结合到A位上，这就是mRNA内部的AUG不会被起始tRNA读出，肽链中间不会出现甲酰甲硫氨酸的原因。

2．肽键的生成经过上一步反应后，在核糖体·mRNA·AA-tRNA复合物中，AA-tRNA占据A位，fMet-tRNAfMet占据P位。在肽基转移酶的催化下，A位上的AA-tRNA转移到P位，与fMet-tRNAfMet上的氨基酸生成肽键。起始tRNA在完成使命后离开核糖体P位点，A位点准备接受新的AA-tRNA，开始下一轮合成反应。

3．移位

肽键延伸过程中最后一步反应是移位，即核糖体向mRNA3‘端方向移动一个密码子。此时，仍与第二个密码子相结合的二肽基tRNA2从A位进入P位，去氨基酰-tRNA被挤入E位，mRNA上的第三位密码子则对应于A位。EF-G是移位所必须的蛋白质因子，移位的能量来自另一分子GTP水解。用嘌呤霉素作为抑制剂做实验表明，核糖体沿mRNA移动与肽基-tRNA的移位这两个过程是耦联的。肽链延伸是由许多个反应组成的，原核生物中每次反应共需3个延伸因子，EF-Tu、EF-Ts及EF-G，它们都具有GTP酶活性，EF-Tu和EF-Ts能够促进AA-tRNA进入A位，EF-G促进转位和卸载tRNA的释放。

真核生物细胞需EF-1及EF-2，消耗2个GTP，向生长中的肽链加上一个氨基酸。

4.4.

4.肽链的终止

肽链的延伸过程中，当终止密码子UAA、UAG、UGA出现在核糖体的A位时，没有相应的AA-tRNA能与之结合，而释放因子能识别这些密码子并与之结合，水解P位上多肽链与tRNA之间的二酯键。接着，新生的肽链和tRNA从核糖体上释放，核糖体大、小亚基解体，蛋白质合成结束。释放因子RF具有GTP酶活性，它催化GTP水解，使肽链与核糖体解离。

细菌细胞内存在三种不同的终止因子（RF1，RF2，RF3），RF1能识别UAG和UAA，RF2识别UGA和UAA。一旦RF与终止