第七章 电泳技术

第七章电泳技术

Electrophoresis7.1概述7.1.1电泳的定义在电场作用下，带电颗粒向着与其电性相反的电极移动的现象

蛋白质研究方面：用于蛋白质分离、纯化、分析、小量制备，分子量、等电点的测定7.1.2蛋白质电泳的分离蛋白质的依据

不同的蛋白质分子，由于其侧链可解离基团的种类和数量、分子质量、空间三维结构都有所不同，所以：等电点（pI）不同同一pH条件，所带电荷种类、数量不同大小、形状不同蛋白质分子在电场中的泳动速度常常用迁移率来表示定义：蛋白质分子在单位电场强度下的泳动速度m==

V=迁移速度；E=电场强度；η=介质粘度在同一介质中电泳，m只与蛋白分子自身大小和形状（r）、所带电荷数量（Q）相关利用蛋白质混合物中各蛋白的迁移率不同（蛋白性质差异造成），而达到分离的效果V—E6πrη_____

Q7.1.3

迁移率（mobility,m）6种蛋白质混合物的电泳结果图7.1.4影响蛋白质电泳速度的内在因素蛋白质分子所带电荷的电性和电量电性决定电泳方向；电量越大，迁移速度越快蛋白质分子的大小和形状分子质量越小、形状越接近球形，在电场中迁移速度越快7.1.5影响蛋白质电泳速度的外在因素溶液pH

决定蛋白质所带电荷的电性和电量

溶液的离子强度

越低，迁移越快；一般应在0.01~0.2mol/L之间电场强度电渗现象电泳支持介质温度7.1.6蛋白质电泳的分类按分离原理的不同

①移界电泳在自由溶液中迁移，引起界面移动。最早，已被取代②区带电泳在介质中迁移，分离成独立区带。目前最常用③稳态电泳迁移到一定时间后达到稳态。如等电聚焦电泳按有无固体支持物

①自由电泳无支持物，如移界电泳、某些等速电泳、柱电泳②支持物电泳有支持物，如聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳、等电聚焦电泳等常用的电泳技术

①常规聚丙烯酰胺凝胶电泳（常规PAGE）②十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳

（SDS）

③等电聚焦（isoelectrofocusing，IEF）④双向电泳（2-Delectrophoresis，2-DE）⑤转移电泳（westerningblotting，Wb）

⑥免疫电泳（immunoelectrophoresis，IE）⑦毛细管电泳（capillaryelectrophoresis，CE）7.1.7电泳仪器基本设备：电泳仪、电泳槽、制胶模具配套设备：冷却装置、凝胶扫描仪、凝胶干燥器等电泳按设备形式的不同分为：①垂直板式电泳②平板式电泳③转移电泳④双向电泳⑤垂直柱式电泳（盘状电泳）

电泳仪

垂直板式电泳槽平板式电泳槽转移电泳槽双向电泳槽垂直柱式电泳槽（盘状电泳槽）凝胶成像系统凝胶干燥器PAGE（polyacrylamidegelelectrophoresis）是以聚丙烯酰胺凝胶作为电泳介质的一种电泳方法聚丙烯酰胺凝胶是一种以丙烯酰胺单体为材料，甲叉双丙烯酰胺为交联剂，在催化剂作用下，把丙烯酰胺单体聚合成三维网孔结构的高分子聚合物7.2

聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）

一、基本原理（一）聚丙烯酰胺凝胶的合成1.丙烯酰胺(Acr)和甲叉双丙烯酰胺(Bis)量的确定凝胶的孔径大小由Acr和Bis在凝胶中的总浓度(T)及Bis占两者的百分含量(C，即交联度)决定

T＝Acr+Bis/v×100%（v：溶液的体积）C＝Bis/Acr+Bis×100%实验表明，当C＝5%时，凝胶筛孔直径最小；大于或小于5%，筛孔直径均变大目前常采用固定值C＝2.6%或5%，再通过选择不同的T值制备不同浓度的凝胶来分离各种蛋白质混合物2.凝胶浓度的选择根据样品中大部分蛋白质的分子量范围

C=2.6%C=5%凝胶浓度/T%分子量范围/kDa凝胶浓度/T%分子量范围/kDa530~200560~7001015~1001022~2801510~501510~200202~15205~150聚丙烯酰胺凝胶浓度与蛋白质分子量的关系3.Acr单体的催化聚合原理两种催化反应类型:化学催化和光催化

①化学催化（最常用）过硫酸铵（AP）作为催化剂

N,N,N’,N’,-四甲基乙二胺（TEMED）作为增速剂②光催化核黄素作催化剂，TEMED作增速剂，需光照和氧分子的参与PAGE可分为（按是否加入SDS和强还原剂）：

常规聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）

十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)常规PAGE对于蛋白质混合物的分离是基于①不同蛋白质分子量大小的不同；②不同蛋白质分子形状的不同；③不同蛋白质所带净电荷的不同。电泳过程中蛋白质能保持天然构象及生物学活性SDS由于加入了SDS和强还原剂（DTT、β-巯基乙醇），对于蛋白质混合物的分离只基于不同蛋白质分子量大小的不同。电泳过程中蛋白质天然构象被破坏，生物学活性丧失（一）常规PAGE的类型按蛋白质所带电荷的电性分类阳极电泳：蛋白质带负电荷，向阳极迁移；缓冲液pH8.0~9.5，常用于分离酸性蛋白质阴极电泳：蛋白质带正电荷，向阴极迁移；缓冲液pH4.0左右，常用于分离碱性蛋白质二、常规PAGE按电泳系统的连续性分类

连续电泳：一般只有分离胶。电泳体系的缓冲液pH及凝胶浓度保持不变不连续电泳：包括浓缩胶和分离胶。浓缩胶和分离胶的缓冲液pH、凝胶浓度都不同

浓缩胶：孔径较大，pH6.8；作用：防止对流，浓缩样品

分离胶：孔径较小，pH8.8；作用：根据蛋白质的大小、形状、所带电荷的种类和数量的不同进行分离

（二）常规PAGE的三大分离效应①浓缩效应蛋白质样品在浓缩胶中被高度浓缩，最终集聚成一条狭窄的高浓度蛋白质区②电荷效应不同蛋白质所带电荷的数量不同，因此迁移率不相同③分子筛效应凝胶对不同分子量的蛋白分子具有的筛分效应。分子质量越小，迁移率越大（三）常规PAGE凝胶浓度的选择应根据样品中大部分蛋白质的分子量范围来选择

如果对样品中蛋白质分子量未知，可先选浓度为7.5%的均一胶进行分离，再根据分离效果做调整和优化一般来说，理想的蛋白质相对迁移率mR范围应在0.25～0.85之间（四）常规PAGE的实验方法制备凝胶原料：丙烯酰胺（Acr）交联剂：甲叉双丙烯酰胺（Bis）化学催化聚合法催化剂：过硫酸铵（AP）加速剂：N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)凝胶的孔径、机械性能、弹性、透明度、粘着度及聚合程度取决于浓度T和交联度CT=Acr+Bis/v

100%C=Bis/(Acr+Bis)

100%C不变，T变大：凝胶孔径变小，胶变硬、脆C不变，T变小：凝胶孔径变大，胶变软T不变，C变大：凝胶变不透明，弹性变小

制胶过程（包括配胶、脱气、灌胶、封水）：先配制各种所需成份的储液，再根据所需T值按比例混合（具体的配方见课本）组装模具，灌制凝胶，防止漏胶对于不连续电泳体系：先制备分离胶，再制备浓缩胶对于垂直平板电泳，在浓缩胶上端插入“梳子”以形成加样孔注意事项：⑴两种单体在固体状态相对稳定，但溶液状态不稳定（4℃保存一个月），丙烯酰胺在储存期间会逐渐水解成丙烯酸而影响凝胶聚合及降低电泳迁移率⑵单体未聚合前是一种对中枢神经系统有毒的试剂，应避免直接接触⑶催化剂和加速剂浓度增加可缩短凝胶的聚合时间，但过量会引起蛋白电泳条带的畸变；一般聚合反应能在40~60分钟完成②

加样样品中不应包含颗粒状不溶物样品应溶于样品缓冲液中，常溶于如下样品缓冲缓冲液：pH6.8,0.3125mol/LTris-HCl，甘油25%，溴酚蓝0.05%上样量的控制（与染色方法有关）

考马斯亮蓝染色法：50~150

g银染法：1~3

g用微量注射器在加样孔中加样，样品加至加样孔底部凝胶面上③电泳恒压下进行电泳（如200V）确保电泳缓冲液和凝胶保持良好的接触，防止短路和断路防止凝胶过热指示剂—溴酚蓝的前沿到达凝胶底部时，电泳结束，应关闭电源后取出凝胶检测(1)考马斯亮蓝染色法考马斯亮蓝R-250和G-250，常用R-250原理：在酸性条件下，蛋白质与考马斯亮兰R-250结合形成蓝色复合物（595nm处最大吸收峰），蓝色的深浅与蛋白质浓度成正比关系染色灵敏度达0.2~0.5

g/条带(2)银染法原理：银染时蛋白条带上的AgNO3被还原成金属Ag，沉积在蛋白条带上而显色显色方法分为化学显色和光显色灵敏度达2ng/条带(3)其他染色方法荧光染料及苯胺黑、氨基黑、丽春红S、快绿FCF、2,4-DNFB等染料电泳结果的保存采用凝胶成像系统对凝胶进行扫描拍照；采用凝胶图像处理软件进行图谱分析凝胶的保存短期保存：浸泡在7%醋酸溶液中长期保存：采用凝胶干燥器进行干燥后保存7.3SDS7.3.1原理去垢剂SDS—十二烷基硫酸钠，CH3(CH2)11OSO3Na，破坏蛋白质分子的氢键和疏水键，并与之结合形成SDS-蛋白质复合物强还原剂β-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT），破坏蛋白分子二硫键结果导致：SDS-蛋白复合物带上大量负电荷，且不同蛋白质有着相同的荷质比（SDS与多数蛋白质的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质）蛋白分子变成椭圆棒状，不同的蛋白分子无形状差别，棒的长度与其分子量成正比

因此对于SDS，蛋白质的迁移率仅与分子量有关7.3.2实验方法SDS中，由于蛋白质与SDS结合后带负电荷，因此属于阳极电泳；方法与常规PAGE类似凝胶缓冲液中加入0.1%SDS样品缓冲液中加1%~2%SDS和1%~6%β-巯基乙醇（或3%DTT）电泳缓冲液中加0.1%SDS一般采用不连续系统（凝胶由浓缩胶和分离胶组成）样品处理：蛋白质溶于样品缓冲液，在100℃水浴中加热3~5min，使蛋白质充分变性染色方法多用考马斯亮蓝法和银染法常应用蛋白质的分离及其分子量的分析7.4等电聚焦电泳（IEF）7.4.1原理利用不同蛋白质的等电点的不同而使其在pH梯度中相互分离的一种电泳技术等电聚焦过程中，蛋白质分子在一个连续而稳定的线性pH梯度中电泳，结果导致每种蛋白质分子迁移到等于其pI的pH处（此时蛋白质分子的净电荷为零），最终聚集形成一个很窄的蛋白区带

在pH梯度中，某蛋白质处于非pI时，由于带净电荷，将向异性电极方向迁移，即向其等电点方向迁移；一旦抵达其等电点位置，因净电荷为零而将停止迁移，所以具有相同pI的蛋白在其pI位置聚焦成一条窄的蛋白带

7.4.2pH梯度的形成方法7.4.2.1载体两性电解质pH梯度

载体两性电解质是一系列多氨基多羧基的混合物，具有相近但不同的pKa和pI值，其pI分布在2.5~10之间，在外电场的作用下，能自然形成pH梯度Ampholyte化学结构式Pharmalyte化学结构式常用的两种载体两性电解质7.4.2.2固相pH梯度

使用一些具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物，它们除与甲叉双丙烯酰胺形成凝胶外，还在滴定终点附近形成pH梯度固相pH梯度与载体两性电解质pH梯度的区别在于前者的分子不是两性分子，在凝胶聚合时便形成pH梯度，不随环境电场条件的改变而改变；后者是两性分子，在电场中迁移到pI后才形成pH梯度固相pH梯度IEF比载体两性电解质pH梯度IEF具有更高的分辨率和更大的上样量，其分辨率可达到0.001pH，是目前分辨率最高的电泳方法之一7.4.3实验方法IEF分为聚丙烯酰胺凝胶IEF和琼脂糖凝胶IEF。聚丙烯酰胺凝胶用于分析分子量小于300kDa的蛋白质，使用浓度约为5%~8%，交联度约为3%；琼脂糖凝胶可分析分子量大至2000kDa的大分子，使用浓度为1%，能用于制备型分离上样时，样品可加到凝胶的任何位置IEF一般采用高电压（上限可至2000V），用以提高分辨率。但维持高电压必须具有良好的凝胶冷却系统，以防止凝胶过热而烧胶主要用于蛋白质等电点（pI）的测定和作为双向电泳中的第一向电泳7.4.4等电聚焦电泳的用途7.5双向电泳7.5.1原理双向电泳（2-dimensionElectrophoresis，2-DE）是样品经第一向电泳后，再在垂直方向上进行第二向其他类型电泳的电泳方式。目前的双向电泳一般是：第一向为等电聚焦（IEF），第二向为SDS2-DE使得分离分辨率大大提高，获得的信息也明显增多，是目前电泳技术中分辨率最高、信息获得最多的技术，常用于分析复杂样品及绘制蛋白质组图谱，是蛋白质组学研究的核心技术双向电泳的示意图及电泳结果效果图7.5.2基于固相pH梯度IEF的双向电泳

步骤:1、样品的制备2、IPG干胶条的再水化3、等点聚焦电泳（IEF）4、IPG胶条进行平衡5、SDS6、染色7、结果分析7.5.3双向电泳的用途利用双向电泳技术不仅能了解样品中各蛋白的等电点、分子量、丰度等信息，更重要的是还可利用比较双向电泳的方法用于了解样品中各蛋白的动态变化情况进一步，还可利用质谱技术结合数据库检索对感兴趣的蛋白点进行种类鉴定，因此目前是蛋白质组学研究中的核心技术7.6荧光差异双向电泳荧光差异双向电泳（2D-FluorescentDifferenceGelElectrophoresis,简称2D-DIGE）是近几年发展起