第九章 微生物的遗传变异和育种

第七章微生物的遗传变异和育种目的与要求：本章主要使学生了解微生物遗传因子的构成、理解其中的概念、术语，掌握基因突变的特点、重要类型，诱变育种的操作过程，理解并掌握原核、真核生物基因重组和杂交育种的原理及方法。重点、难点（1）基因突变的特点及重要类型（2）证明基因突变自发性和不对称性的的原理（3）诱变育种的原理、方法及操作过程（4）基因重组及杂交育种的类型、原理遗传：亲代与子代相似变异：亲代与子代、子代间不同个体不完全相同遗传（inheritance）和变异（variation）是生命的最本质特性之一遗传型：表型：生物的全部遗传因子所携带的遗传信息具有一定遗传型的个体，在特定环境条件下通过生长发育所表现出来的外表特征和内在特征的总和。表型是由遗传型所决定，但也和环境有关。表型饰变：表型的差异只与环境有关特点：暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为遗传型变异（基因变异、基因突变）：遗传物质改变，导致表型改变特点：遗传性、群体中极少数个体的行为（自发突变频率通常为10-6-10-9）Productionofaredpigment(prodigiosin)bySerratiamarcescens.

Fromlefttoright:slantculturegrownat25°C,slantculturegrownat37°C,brothculturegrownat25°C,brothculturegrownat37°C.

微生物是遗传学研究中的明星？第一节遗传变异的物质基础一、证明核酸是遗传物质基础的三个经典实验（一）经典转化实验（transformation）：F.Griffith（二）噬菌体感染实验：A.D.Hershey和M.Chase（三）植物病毒的重建实验：H.Fraenkel-Conrat（1）动物实验混合培养SIII型活菌SIII型热死菌RII型活菌SIII型活菌健康健康健康健康健康病死病死病死Griffith转化试验示意（2）细菌培养实验（3）S型菌的无细胞抽提液试验热死SIII菌—————不生长

活RII

菌—————长出RII菌

热死SIII菌—————长出大量RII菌和10-6SIII菌活R菌+S菌无细胞抽提液——长出大量R菌和少量S菌+活RII菌平皿培养1944年，Avery精确重复了转化实验，确定了转化因子实验证明，将R菌转化为S菌的转化因子是DNA（二）噬菌体感染实验A.D.Hershey和M.Chase，1952年（1）含32P-DNA的一组：放射性85%在沉淀中10分钟后用捣碎器使空壳脱离吸附离心沉淀细胞进一步培养后，可产生大量完整的子代噬菌体上清液中含15%放射性沉淀中含85%放射性沉淀中含25%放射性以32S标记蛋白质外壳做噬菌体感染实验（2）含35S-蛋白质的一组：放射性75%在上清液中10分钟后用捣碎器使空壳脱离吸附离心沉淀细胞进一步培养后，可产生大量完整的子代噬菌体上清液中含75%放射性（三）植物病毒的重建实验因此:只有核酸（DNA、RNA）才是负载遗传信息的真正物质基础。二、遗传物质在微生物细胞内存在的部位和方式细胞水平：存在于细胞核或核区细胞核水平:

原与真核生物的细胞核结构不同，(核仁、固定形态、与组蛋白结合）核外DNA染色体水平:

不同生物染色体数p193染色体倍数：同一细胞中相同染色体的套数核酸水平：DNA或RNA，复合或裸露，双链或单链基因水平：基因：生物体内，一切具有自主复制能力的最小遗传功能单位，它的物质基础是一个具特定核苷酸顺序的核酸片段，大小为1000-1500bp功能：表达和产生基因产物原核生物基因的表达通过组成操纵子形式：命名原核生物的基因结构的特点：1）染色体为双链环状的DNA分子（单倍体）；2）基因组上遗传信息具有连续性；3）功能相关的结构基因组成操纵子结构；4）结构基因的单拷贝及rRNA基因的多拷贝；5）基因组的重复序列少而短；真核微生物（啤酒酵母）的基因结构的特点：1）基因的非连续性

2）没有明显的操纵子结构

3）转录和转译有空间间隔

4）重复序列多密码子水平：遗传密码：指DNA链上决定各具体氨基酸的特定核苷酸排列顺序。 密码子：信息单位核苷酸水平：

最低突变或交换单位，四种核苷酸核外DNA的种类核外染色体真核生物的“质粒”原核生物的质粒 线粒体细胞质基因 叶绿体（质体） 卡巴颗粒酵母菌的2m质粒F因子R因子Col质粒Ti质粒巨大质粒降解性质粒三、原核生物的质粒质粒（plasmid）：独立于核基因组外，能自主复制的小型共价闭合环状的双链DNA分子（一

）质粒的分子构型通常以共价闭合环状(covalentlyclosedcircle，简称ccc)的超螺旋双链DNA分子存在于细胞质中；也发现有线型双链DNA质粒和RNA质粒（二）典型质粒质粒所编码的功能和赋予宿主的表型效应F质粒（Fertilityplasmid

，F因子）R质粒（Resistanceplasmid

，R因子）Col质粒（colicinplasmid）Ti质粒（tumorinducingplasmid）Ri质粒（rootinducingplasmid)巨大质粒降解性质粒P199-201(三)质粒的主要生物学性质1、质粒的自我复制2、质粒的存在形式：独立存在、附加体3、质粒携带的基因4、质粒的亲和性和不亲和性5、有的质粒具有转移性6、拷贝数严紧型质粒和松弛型质粒三、质粒在基因工程中的应用

质粒在基因工程操作中的优点：1.体积小，便于DNA的分离和操作；2.呈环状，在化学分离过程中能保持稳定性；3.有不受核基因组控制的独立复制起始点；4.拷贝数多，使外源DNA可快速扩增；5.存在抗药性基因等选择性标记，便于含质粒克隆的检出和选择。E.Coli

的PBR322质粒第二节基因突变和诱变育种基因突变(genemutation)指细胞(或毒粒)内遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变化。突变的原因：自发突变、诱变基因突变狭义：点突变广义：基因突变和染色体畸变突变株（mutant）：野生型（wildtype）：一、基因突变的类型按是否比较容易、迅速地分离到发生突变的细胞来分：选择性突变株（selectivemutant）：1.营养缺陷型（auxotroph）2.抗性突变型3.条件致死突变型非选择性突变株（non-selectivemutant）：4.形态突变型5.抗原突变型6.产量突变型（二）突变率定义：每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。突变率也可以用每一单位群体在每一世代中产生突变株（mutant，即突变型）的数目来表示。突变率=突变细胞数/分裂前群体细胞数（三）基因突变的特点1、自发性：2、不对应性：3、稀有性：4、独立性：5、可诱变性：6、稳定性：7、可逆性：（四）基因突变的自发性和不对应性的证明1.变量试验fluctuationtest2.涂布试验3.平板影印培养试验（replicaplating）变量试验又称波动试验或彷徨试验。

1943年，S.E.Luria和M.Delbrück根据统计学原理，设计了左方的实验。1.变量试验fluctuationtest2.Newcombe涂布试验原理与变量试验相同，方法更为简便，且可计算突变率。3.平板影印培养试验（replicaplating）1952年，J.Lederberg夫妇的论文《平板影印培养法和细菌突变株的间接选择》平板影印培养法（五）基因突变的机制基因突变的具体类型可归纳如下：1、诱变机制诱发突变：利用物理、化学、生物的因素，提高突变率的人为的作法诱变剂（mutagen）：凡能提高突变率的任何理化生物因子（1）碱基置换（substitution）定义：属于一种染色体的微小损伤（microlesion它只涉及一对碱基被另一对碱基所置换。分类：转换（transition）颠换（transversion直接引起置换的诱变剂定义：一类可直接与核酸的碱基发生化学反应的诱变剂，不论在机体内或是在离体条件下均有作用。种类：亚硝酸、羟胺和各种烷化剂（硫酸二乙酯，甲基磺酸乙酯，N-甲基-N’硝基-N-亚硝基胍，N-甲基-N-亚硝基脲，乙烯亚胺，环氧乙酸，氮芥等）。作用：它们可与一个或几个核苷酸发生化学反应，从而引起DNA复制时碱基配对的转换，并进一步使微生物发生变异。这类诱变剂主要是一些碱基类似物

,如：5-溴尿嘧啶(5-BU)和5-氨基尿嘧啶（5—AU）、叠氮胸腺嘧啶（AIT）等；

作用方式：通过活细胞的代谢活动参入到DNA分子中，主要是在DNA复制时碱基类似物插入DNA中，引起碱基对配对错误，造成碱基置换。间接引起置换的诱变剂（2）移码突变frame-shiftmutation

指诱变剂使DNA分子中增加（插入）或缺失一个或少数几个核苷酸，从而使该基因该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的一类突变。吖啶类染料，包括原黄素、吖啶黄、吖啶橙和α-氨基吖啶等，以及一系列称为ICR类的化合物吖啶类化合物诱发的移码突变及其回复突变图示：（3）染色体畸变（chromosomalaberration）某些理化因子，还会引起DNA的大损伤（macrolesion）——染色体畸变，它包括：染色体结构上的变化：缺失（deletion）重复（duplication）易位（translocation）倒位（inversion）染色体数目的变化转座（transposition）转座：

DNA序列通过非同源重组的方式，从染色体的某一部位转移到同一染色体的不同部位或不同的染色体上某一部位的现象专座因子：具有转座作用的这段DNA序列，也称作跳跃基因（jumpinggene）或可移动基因（movablegene）转座因子的种类：插入序列（IS，insertionsequence）：转座子（Tn，transposon）Mu噬菌体（即mutatorphage）转座因子特点：非同源重组的方式转移到染色体的新部位两端各有一段末端重复序列具有转座酶基因2、自发突变：无人为因素下的低频率突变其原因：（1）背景辐射和环境因素引起（2）有害产物积累（3）碱基错配（六）紫外线对DNA的损伤及其修复嘧啶嘧啶二聚体UV1、光复活作用嘧啶二聚体嘧啶光解酶2、切除修复（一）自发突变与育种1、从生产中育种如：抗噬菌体感染，“上酒白种”．2、定向培育优良菌株（“驯化”）如：炭疽活菌疫苗，卡介苗．（二）诱变育种诱变育种是指利用物理、化学等诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，在促进其突变率显著提高的基础上，采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选出少数符合育种目的的突变株，以供科学实验或生产实践使用。二、突变与育种1、诱变育种的基本原理和环节：2、诱变育种的一般步骤出发菌株↓纯化、活化、同步培养培养液↓离心收集细胞、洗涤，制备均一的菌悬液（玻璃株打散、过滤）单细胞或单孢子悬液↓活菌计数，诱变预备试验诱变处理↓活细胞计数，致死率计算中间培养(后培养)↓平板分离↓变异率计算初筛→复筛→保藏及扩大试验1）选择简便有效的诱变剂2）挑选优良的出发菌株（originalstrain）3）处理单细胞或单孢子悬液4）选用最适的诱变剂量5）充分利用复合处理的协同效应（synergism）6）利用和创造形态、生理与产量间的相关指标7）设计高效筛选方案（筛选比诱变更重要）8）创造新型筛选方法3、诱变育种中的几个原则诱变育种的主要环节：诱变和筛选（1）诱变紫外诱变方法:设备：紫外灯、磁力搅拌器、暗室等紫外灯：波长为253.7nm,功率是15W处理时的照射距离：20cm—30cm样品：要直接暴露在紫外灯下，厚度不能超过3mm照射时，要用磁力搅拌器搅拌。处理剂量：用死亡率（70%—75%）表示照射剂量化学诱变剂：NTG检测化学诱变剂的操作Ames试验：是一种利用细菌营养缺陷型的回复突变来检测环境和食品中是否存在化学致癌剂的简便有效方法。原理：原因：化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成正比，超过95%的致癌物质对微生物有诱变作用，90%以上的非致癌物质对微生物没有诱变作用Ames试验的操作：（2）菌种筛选1、初筛和复筛两步进行初筛的目的：以量为主（选留有生产潜力的菌株）复筛的目的：复筛以质为主，应精确测定生产潜力较大的每个菌株的生产指标，确认符合要求的菌株2、以选育高产突变株为例，诱变育种的筛选过程如下：第一轮：一个出发菌株→→→选出200个菌株→→→选出50株→→→选出5株诱变处理初筛（每瓶一株）复筛（每瓶四株）第二轮：5个出发菌株→→→→→→选出50株→→→选出5株40株40株40株40株40株诱变处理初筛复筛（每瓶一株）（每瓶四株）诱变处理3、变异菌的一般筛选方法平皿快速检测法变色圈法透明圈法生长圈法抑菌圈法梯度平板法摇瓶培养法4、特殊变异菌的筛选方法：（1）产量突变株的筛选

琼脂块培养法（2）抗药性突变株的筛选

梯度平板法（3）营养缺陷型突变株的筛选

a.与营养缺陷型突变有关的概念：野生型：营养缺陷型：原养型：基本培养基：完全培养基:补充培养基;营养缺陷型突变株的筛选方法诱变检出营养缺陷型淘汰野生型鉴定营养缺陷型富集培养（抗生素法）（菌丝过滤法）夹层培养法限量补充培养法逐个检出法影印平板法生长谱法第三节基因重组和杂交育种基因重组（generecombination）：两个独立基因组内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成稳定的新遗传型的过程重组与杂交的关系：基因重组是杂交育种的理论基础。一、原核微生物的基因重组基因重组的方式：转化转导接合原生质体融合（一）转化（transformation）1、转化及其发现：定义：感受态受体菌直接摄取来自供体菌的游离DNA片段，经重组而获得后者部分遗传性状的现象，称为转化。转化后的的受体菌称为转化子（transformant）。发现：R型活菌+S型死菌→→S型活菌2、转化发生的条件①受体细胞要处于感受态（competence）.②外源游离DNA分子（转化因子）③菌株间的亲缘关系密切3、感受态细胞形成的方式：自然感受态人工感受态感受态因子：调节感受态的一类特异蛋白质，主要包括膜相关DNA结合蛋白、细胞壁自溶素和几种核酸酶。4、转化的过程以S.Pneumoniaestr（肺炎链球菌抗链霉素菌株）为例，大致可分为六阶段：吸附：切割：入胞：重组：复制：转化子形成：转化的过程strr5、转染（transfection）定义：把噬菌体或其它病毒的DNA（或RNA）抽提出来，让它去感染感受态的宿主细胞或原生质体，并进而产生正常的噬菌体或病毒的后代，这种现象称为转染（transfection）。与转化的区别：病毒或噬菌体核酸并非作为供体基因的功能中间不发生任何遗传因子的交换或整合最后不产生转化子（二）细菌的转导（transduction）1.转导及其发现转导：由缺陷噬菌体介导的，把供体细胞的小片段DNA携带进受体细胞中进行遗传交换与整合使受体细胞获得前者部分遗传形状的现象J.Lederberg等（1952）在Salmonellatyphimurium（鼠伤寒沙门氏菌）中发现的。AB[-][-]Try+his+Try-his+Try+his-2.转导的种类转导普遍转导局限转导完全普遍转导流产普遍转导低频转导高频转导（1）普遍性转导（generalizedtransduction）定义：通过极少数完全缺陷噬菌体对供体菌任何DNA小片段的“误包”而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象媒介：温和噬菌体（P22噬菌体）分类：完全普遍转导流产普遍转导完全普遍转导的过程进入受体的外源DNA通过与细胞染色体的重组交换而形成稳定的转导子流产普遍性转导（abortivetransduction）概念：

受体菌经转导获得的供体DNA片段在受体菌中不发生配对交换和整合、复制，也不迅速消失，而只是进行转录和转译（性状表达），这种现象就称为流产普遍转导。现象：进行细胞分裂时，只能将这段外源DNA分配给一个子细胞。流产普遍性转导的过程（2）局限性转导定义：通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并与后者基因组整合、重组形成转导子的现象。分类：低频转导与高频转导低频转导高频转导双重溶源菌温和噬菌体λ裂解时的不正常切割：包含gal或bio基因缺陷噬菌体DNA分子在宿主细胞内能够象正常的λDNA分子一样进行复制、包装，提供所需要的裂解功能，形成转导颗粒，但没有正常噬菌体的溶源性和增殖能力，感染受体细胞后，通过DNA整合进宿主染色体而形成稳定的局限转导子。低频转导低频转导裂解物正常噬菌体极少量的部分缺陷噬菌体（局限转导噬菌体）转导颗粒局限转导子（极少量）低感染复数高频转导低频转导裂解物正常噬菌体极少量的部分缺陷噬菌体（局限转导噬菌体）转导颗粒高感染复数双重溶源菌缺陷噬菌体和正常噬菌体同步复制高频转导裂解物部分缺陷噬菌体（局限转导噬菌体）正常噬菌体等量转导颗粒局限转导子（大量）低感染复数E.coli

K12(

)gal+(供体菌)(大量)+dgal+（10-5）E.coliK12Sgal-(受体菌)E.coliK12Sgal-/

dgal+E.coliK12Sgal-/

dgal+/

E.coliK12Sgal-/

dgal+/

（双重溶源菌供体）

(50%)+dgal+（50%）E.coliK12Sgal-(受体菌)E.coliK12Sgal-/

dgal+（转导子）

（双重容源转导子）高频转导和低频转导图解低频转导高频转导U.V.U.V.普遍性转导与局限性转导的异同

相同点：均以噬菌体为媒介，导致遗传物质的转移。 不同点： 普通性转导局限性转导