漆酶介体系统处理尾叶桉硫酸盐浆生物漂白

漆酶介体系统处理尾叶桉硫酸盐浆生物漂白

传统砂浆漂白中使用的浮白剂之一是氯。氯可以很好地去除残余的木素，而氯和多氯优雅的化合物是深层、有毒和可导致副作用的材料。因此,由造纸漂白车间排出的废水对自然环境造成严重污染,危害人类的生存安全。由于人们环保意识的加强,环境对制浆造纸工业的压力越来越大,市场对纸的需求也发生了变化,特别是对各种食物包装的需要。近年来,研究无元素氯和完全无氯漂白在国际范围迅速展开,各种技术的发展也很快。发展生物技术漂白纸浆,是国际上近年来研究的热门课题。生物漂白就是利用微生物或者其分泌的酶处理纸浆,达到脱除木素或有利于脱木素,并改善纸浆的可漂性或提高纸浆白度的过程。Viikari等利用半纤维素酶预处理纸浆,不仅可以减少化学药品的用量,降低污染,而且可以提高纸浆的白度,改善纸浆的质量,并且有利于进行无元素氯漂白。但是半纤维素酶不能直接降解浆中残余木素,不能从根本上解决残余木素的脱除问题。利用微生物(白腐菌)直接作用于纸浆,也可以脱除残余木素达到漂白的效果。Paice等人用芸芝(C.versicolor)处理阔叶木硫酸盐浆,5天后白度提高15%ISO,卡伯值下降3.7个单位;Fujita用白腐菌IZU-154漂白阔叶木硫酸盐浆,5天后白度提高21%ISO,卡伯值下降20.6个单位。经白腐菌处理后,再经其他无氯漂白程序,可以得到高白度的纸浆。但是直接用活体菌还存在作用周期长,纸浆需经灭菌等问题,不利于工业生产。利用木素降解酶的生物漂白显得特别有利,因为它能直接作用于浆中的残余木素,使之降解。到目前为止,已经发现的木素降解酶有,木素过氧化物酶(Lip)、锰过氧化物酶(Mnp)和漆酶(Laccase)。在这三种酶中,漆酶被认为是在纸浆漂白工业中最具有应用前景的酶。近年,国际上有许多关于漆酶在作为电子传递的介体(mediator)参与下进行生物漂白的报道。一般认为,漆酶/介体脱木素过程中存在一个氧化还原循环,即漆酶氧化介体形成小分子自由基,并扩散到纸浆中,然后与纸浆中的木素反应,使之降解,达到漂白的目的。此漆酶/介体反应体系中,没有介体存在时漆酶不能使木素降解,甚至发生聚合,因此介体起重要作用。目前发现最有效的介体有2,2’-连氮-二(3-乙基噻唑-6-磺酸)(简称ABTS)和1-羟基-苯并三唑(简称HBT)。最近,发现另一种含N-OH的新的化合物N-羟基-乙酰苯胺(NHA)在漆酶生物漂白中具有更好的效果。我们利用从白腐菌产生的漆酶与新的介体NHA构成LMS(Laccase-MediatorSystem)体系,进行尾叶桉纸浆的生物漂白研究。1原料和实验方法1.1木片的制备尾叶桉(Eucalptusurophylla)木片由广东省雷州林业局提供,分别用常规硫酸盐蒸煮(CK)法和深度脱木素改良硫酸盐连续蒸煮(EMCC)法蒸煮获得纸浆。1.1.1蒸煮条件确定蒸煮器为计算机控制的蒸煮锅(M/K609-2-10),美国M/KSYSTEMS公司制造。CK浆蒸煮条件为:装锅量1000g(绝干),用碱量17%(以NaOH计),硫化度30%,液比1∶4。最后得CK浆的卡伯值为21。EMCC浆蒸煮条件为:液比1∶4,浸渍区加入白液用碱量10%,顺流蒸煮区加入白液用碱量5%,逆流蒸煮区补加白液浓度33.8g/L。最后得EMCC浆的卡伯值为15.1。1.1.2制备nh-pcr反应实验条件:绝干浆100g装于氧漂锅,调节浆浓为10%,NaOH用量2%,MgSO4用量0.5%,温度90℃,氧气压力1MPa,反应1h。最后EMCC-氧脱木素浆卡伯值为10.9。1.2油漆酶1.2.1引起的氧化酶白腐菌(Panusconchatus)固体发酵20d,制取粗酶液,然后分离纯化,得到纯化漆酶。1.2.2吸光度的变化漆酶活力的测定是以ABTS为底物,测定氧化的ABTS在420nm的吸光度变化来确定。一个漆酶酶活单位定义为漆酶在1min内氧化1μmolABTS,氧化的ABTS的摩尔吸光度为3.6×104L/(mol·cm)。1.3介质体N-乙酰基苯胲(NHA)按文献的方法自行合成。1.4油漆介体系统lms处理纸浆和过氧化氢漂白1.4.1由朱姆处理纸浆桉木硫酸盐浆,在适量漆酶与介体存在下,通入氧气,控制适当的温度进行反应。1.4.2碱抽提料浆料经L/M处理后,用去离子水洗净,对浆料进行碱抽提。条件为:浆浓为10%,NaOH用量2%,在70℃恒温下作用90min,处理完后取出浆料,用去离子水洗净。1.4.3edta螯合法经漆酶/NHA催化体系氧化后的纸浆或经碱抽提的纸浆,在浆浓10%,pH6.5,50℃条件下与1.0%(绝干浆,下同)EDTA螯合处理30min,然后用去离子水洗涤。再调节浆浓为10%,加入NaOH2.0%,过氧化氢2.0%,以及硫酸镁0.5%和EDTA0.2%,在90℃下反应4h,即进行过氧化氢漂白。1.5纸分析纸浆的白度、粘度和卡伯值按文献标准方法进行测定。2结果和讨论2.1基于桉木/介体生物漂导剂的生物活性工艺漆酶在介体的存在下与纸浆残余木素的反应是一个复杂的有机反应过程,为了确立漆酶/介体生物漂白的优化工艺条件,我们以桉木EMCC浆作为原料,从漆酶和介体的用量,酶催化反应体系的温度、pH值,体系的氧气压力以及反应时间进行探索。2.1.1漆酶/介体l/m处理脱木素施工实验主要参数漆酶在生物漂白过程中很关键,它的用量对纸浆的生物漂白脱木素程度将有直接影响。虽然漆酶在反应中作为生物催化剂,但是随着反应的进行,有可能会使部分漆酶失活,因此漆酶太少,达不到充分脱除木素,就会影响纸浆的白度。当然我们期望能在使用少量漆酶的情况下使纸浆获得较佳的性能,为了达到此目的,有必要探索较佳的漆酶用量。在实验中对漆酶用量分别为1U/g浆、2.5U/g浆和5U/g浆几种条件下进行漆酶/介体(L/M处理)脱木素反应的探索,分析纸浆中卡伯值的变化情况,并对L/M处理后的纸浆再进行碱抽提,以及过氧化氢漂白,比较纸浆的粘度和白度,结果如图1和图2(实验的具体反应条件在图2下方)。从图1可以看出,漆酶的用量为2.5U/g浆时,已达到脱木素的效果,不管是测定未经碱抽提(即L/M),还是经碱抽提(即L/ME)纸浆的卡伯值,不会因增加漆酶用量而明显降低。如图2所示,纸浆经L/ME处理后,再经QP漂白,随着漆酶用量的增加,纸浆的粘度有所降低,但浆的白度增加。在漆酶处理时,与漆酶用量为1.0U/g浆比较,漆酶用量为2.5U/g浆和5U/g浆的纸浆经QP漂白后的粘度降低不多。但浆的白度增加明显,当漆酶用量为2.5U/g浆时,纸浆再经QP漂白的白度,比漆酶用量为1.0U/g浆提高15%ISO。因此,在漆酶/NHA生物漂白体系中,漆酶的用量选用2.5U/g浆。2.1.2nha用量的影响NHA是漆酶漂白系统中的介体,在漆酶和木素间起传递电子作用,即漆酶氧化介体形成小分子自由基,并扩散到纸浆中,然后与纸浆中的木素反应,发生电子转移,在木素中形成自由基,然后木素自由基发生一系列的非酶反应,使木素发生降解,达到漂白的目的。因此适量的介体可以提高漆酶的利用率。选用NHA用量分别为绝干浆的0%、0.1%、0.5%、1%、2%进行实验。分析纸浆中卡伯值的变化以及过氧化氢漂白后的粘度和白度,实验结果见图3和图4(实验的具体反应条件在图4下方)。图3表明在不同用量的NHA条件下,纸浆经L/M或L/ME处理后的卡伯值变化。结果表明,当NHA用量小的时候,在生物处理过程中,增加NHA用量,可使浆的卡伯值明显下降,但在NHA用量达1%之后,卡伯值基本上持平。也就是说,在相同的处理条件下,介体NHA用量达到1%足以使木素降解到最少。图4反映经L/M处理然后经过氧化氢漂白后纸浆的粘度和白度变化。从图中可以看出,介体用量增加,经L/MEQP漂白后纸浆的粘度略有降低。经L/MEQP漂白后纸浆的白度在NHA用量为0.1%～2.0%间有较大提高,但相差不大,其中以NHA用量为1%时白度最高。综合考虑,NHA用量为1%时,卡伯值最低,白度较高,故选用1%NHA用量较为适宜。2.1.3最佳ph值的确定对于酶参与的生物化学反应,pH值的影响是一个重要因素。适当的pH值有利于提高漆酶的反应活性,漆酶在最佳pH条件下,可以最大程度降低纸浆中木素的含量,并使纸浆获得较佳的性能。分别选用pH值为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0几种条件,进行漆酶/介体(即L/M处理,具体反应条件在图6下方)脱木素反应的探索,然后分析纸浆卡伯值的变化,并对L/M处理后的纸浆再进行碱抽提,以及过氧化氢漂白,比较纸浆的粘度和白度,以获得漆酶生物漂白的最佳pH值。从图5可以看出,在pH4～8范围内,pH值为5时,浆的卡伯值最低,说明此pH值下漆酶与NHA构成的催化体系脱木素能力最强。降低或升高pH值,纸浆卡伯值均增加。其实不同的介体,反应的最佳pH值不尽相同,如漆酶与ABTS的最佳pH值为4。从图6可以看出,pH值为5时,白度最高;而pH值为6时,纸浆的粘度最高,而白度相差不大,所以pH值选择5～6较佳。2.1.4可加碱处理时煤系过氧化氢漂从纸浆漂白工艺上讲,反应时间过长是不合适的,然而如果时间不够,漆酶与木素反应不完全,达不到充分脱木素效果。为此对漆酶/介体系统与纸浆作用不同时间的脱木素效果,以及生物处理后接着进行过氧化氢漂白纸浆的白度和粘度进行比较。结果见图7和图8(实验的具体反应条件在图8下方)。从图7可以看出,纸浆卡伯值随生物处理时间延长而下降,当L/M处理4h以上,纸浆的卡伯值基本上稳定在11.0左右,经碱处理后,下降幅度也基本差不多。从图8可以看出,L/M处理时间超过2h后,粘度值基本稳定。纸浆的白度经L/M处理2h后,能达到80%ISO以上。延长生物处理时间,白度有所增加,但是增加的幅度并不大,为了降低纸浆的卡伯值,生物处理时间在2h以上较为合适。2.1.5生物处理温度对于生物酶的反应,温度是一个非常重要的因素。太低的反应温度可能使反应时间延长或者反应不完全,太高的温度可能使生物酶失活或者引发其他副反应。本研究漆酶/介体处理所选用的温度分别为40℃、50℃、60℃和70℃,以探索较佳的生物反应温度。结果见图9和图10(实验的具体反应条件在图10下方)。图9表明纸浆经L/M处理以及碱抽提后纸浆卡伯值的变化,L/M处理温度为50℃时,卡伯值下降得最多,说明在此温度进行漆酶/介体脱木素较为有利;L/M处理温度较低时,可能是由于反应速度慢,纸浆中的木素未充分脱除,所以卡伯值较高;L/M处理温度较高时,有可能会使酶部分失活,脱木素能力下降,纸浆的卡伯值也会偏高。从图10可以看出,生物处理温度为40℃到70℃时,经L/MEQP漂白后纸浆的粘度相差并不大,但生物处理温度为50℃时,白度最高。因此,从纸浆的卡伯值、粘度和白度几方面综合考虑,L/M生物处理温度为50℃较佳。2.1.6通气温度对卡伯值的影响为了探索氧气在反应体系中的作用大小,以及可否用空气代替氧气,对此进行了系统实验。L/M处理的实验条件:浆浓10%,NHA用量1%,漆酶用量2.5U/g浆,pH5.0,温度为50℃,反应时间2h。图11显示各种通气条件下卡伯值的变化。首先用氮气将体系中的氧气排尽,然后在基本无氧的条件下进行反应,结果发现不能发生脱木素反应,说明漆酶的反应是好氧条件。在漆酶/介体的反应体系仅通空气,亦能使纸浆发生脱木素反应,但是脱木素的程度比通氧气条件时差。图12显示经过氧化氢漂白后纸浆的粘度和白度,结果表明,各种处理条件下纸浆的粘度变化并不大,随着氧气的压力增大,纸浆的白度增高,当氧气的压力达到0.1MPa后,纸浆漂成高白度,达80%ISO以上,氧气压力为0.3MPa时,纸浆的白度最高。2.2不同程序对豆浆硬度的影响为了考察漆酶/介体生物催化体系对于不同硬度纸浆的脱木素情况,选用尾叶桉常规硫酸盐蒸煮硬度较高的CK浆(卡伯值21),和硬度较低的经氧脱木素后的EMCC浆(卡伯值10.1),利用漆酶/介体(NHA)/氧气体系对纸浆进行生物氧化处理,将漆酶氧化处理后的纸浆进行碱抽提,然后用碱性过氧化氢漂白。进行上述处理后,其不同阶段的纸浆卡伯值变化见表1、图13和图14。图13和图14表明,两种不同硬度的纸浆经上述序列处理,纸浆卡伯值变化趋势类似。但是高硬度的纸浆经漆酶氧化处理,卡伯值的下降程度大于低硬度的纸浆。CK浆经漆酶/NHA处理,卡伯值能降低17%,再经碱抽提后卡伯值降低34.8%;而EMCC氧脱木素浆经漆酶/NHA处理,卡伯值仅下降6.9%。比较各种程序经过氧化氢漂白后的卡伯值发现:低硬度的浆终卡伯值更低;并且经L/MEQP处理后的卡伯值最低,但是与其他处理的差别不十分明显。然而纸浆白度的变化比较明显(图15,16),对于CK浆,经L/MQP程序漂白,白度从38.1%ISO提高到81.7%ISO,氧脱木素-EMCC浆的白度从50.2%ISO提高到87.6%ISO,达到了高白度。此研究中最有趣的结果是,无论对高卡伯值的CK浆,还是低卡伯值的氧脱木素-EMCC浆,漆酶/介体氧化处理后直接进行QP处理,即经L/MQP漂白后纸浆的白度比L/MEQP程序漂白的白度更高。然而许多的同类研究中,经漆酶/介体处理后需要经过碱抽提,然后进行过氧化氢漂白。Poppius-Levlin利用漆酶/HBT处理松木硫酸盐浆,包括常规浆和氧脱木素浆,其结果也是氧脱木素后的纸浆最后白度更高。但是其L/MQP漂白较L/MEQP漂白纸浆的