南医生化实验报告1

生物化学实验报告一、实验目的1.熟悉Folin-酚试剂法定量测定蛋白质的实验原理、操作流程以及注意事项。2.掌握制作三线表和标准曲线的方法。3.学会根据标准曲线及其方程求出待测样品中蛋白质含量。4.掌握V-1100型可见光分光光度计的使用方法以及注意事项。二、实验原理1.在碱性条件下，蛋白质中的肽键能与铜离子作用，形成紫色或者紫红色的蛋白质-Cu2+络合物。该原理与双缩脲反应类似，可用于检验蛋白质。2.蛋白质中含有带酚羟基的酪氨酸，可将磷钼酸盐-磷钨酸盐（Folin试剂）还原，生成蓝色的化合物，显示蓝色反应。3.上述Folin-酚显色反应中，在一定范围内，蓝色的深浅度与蛋白质的浓度成线性关系。所以可以使用V-1100型可见光分光光度计，以500nm波长比色，测定牛血清白蛋白标准液各标准浓度所对应的吸光度值A500，用于绘制标准曲线，得到线性方程。从而根据样品液的吸光度值求出其对应的浓度。三、材料与方法：1.实验材料样品：健康人血清（稀释300倍）试剂：蒸馏水、牛血清白蛋白标准液、碱性硫酸铜溶液、Folin-酚试剂仪器：6支试管、试管架、加样枪、加样枪架、恒温水浴箱、V-1100型可见光分光光度计实验流程蛋白质溶液按比例稀释→添加2ml碱性硫酸铜溶液，混匀→室温下放置10min→添加0.2mlFolin-酚试剂，2s内混匀→40℃水浴加热10min→冷却至室温→测定A500并记录数据→绘制图表，获取方程→求出样品蛋白质浓度具体过程如下：（1）取6支试管，依次编号，如下表所示添加试剂并混合均匀。试剂（ml）123456牛血清白蛋白标准液-0.20.40.60.8-样品液-----0.5蒸馏水1.00.80.60.40.30.5分别向6支试管中添加2ml碱性硫酸铜溶液，混合均匀，并在室温下放置10分钟。分别向6支试管中添加0.20mlFolin-酚试剂，并在2s之内迅速混合均匀。将6支试管置于恒温水浴箱，40℃水浴加热10分钟后冷却至室温。使用V-1100型可见光分光光度计，以500nm波长比色，每管重复测定3次A500，并记录下数据。将所记录数据用于绘制标准曲线并求出线性方程。将样品的吸光度值代入所求方程，得出样品中的蛋白质浓度。结果与讨论实验结果实验数据测定次数2345610.0540.0950.1540.1750.13320.0630.1010.1660.1750.13630.0620.1020.1640.1740.134A500平均值0.0600.0990.1610.1750.134标准曲线即所得线性方程为A=0.0012C实验结果 已知所测样品A500=0.134，代入方程A=0.0012C，得C=111.667μg/ml。因为样品为稀释300倍的健康人血清，且在实验第一步时与蒸馏水以1:1的体积混合，相当于稀释了2倍，故一共稀释了600倍。因此，原样品（健康人血清）C=111.667μg/ml×2×300＝67000μg/ml=67mg/ml=67g/l。查阅资料得健康人血清蛋白质含量正常范围是60-80g/L，因此本次实验结果正确。讨论总结试述Folin-酚试剂法的优点？1）Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基还原，产生蓝色反应。反应迅速灵敏，现象明显，便于观察与测定吸光度。2）Folin—酚试剂法测定蛋白质含量实验中，在一定的条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比。因此可以根据两个变量之间的线性关系，求得吸光度A500与蛋白质浓度C之间的方程。求得方程后可根据样品的A500求出样品的蛋白质含量。3）Folin—酚试剂法测定蛋白质含量实验中，不同蛋白质之间所得实验结果差异不大，可选取的试剂种类更为丰富。4）Folin-酚试剂法与微量凯氏定氮法、考马斯亮蓝染色法等其他测定蛋白质的方法相比，操作更为简便。（2）应用本方法有哪些干扰作用？为什么？应如何注意？经过课外查阅资料可得下面结论：1）干扰物质：硫酸铵、Tris缓冲液、蔗糖等巯基化合物；酚类及柠檬酸；浓度较高的尿素、胍、乙醚、丙酮、三氯乙酸、硝酸钠、硫酸钠等。2）原因：因为Folin-酚试剂法中应用了双缩脲反应，而上述物质均带有干扰双缩脲试剂的基团，因此也会干扰Folin-酚试剂法。3）注意：为了避免干扰，操作过程中应防止该类物质进入试管中；当样品酸度高，应增加碳酸钠-氢氧化钠浓度以靠近实验所需的碱性环境，使显色反应更为明显；当存在浓度较高的尿素、胍、乙醚、丙酮、三氯乙酸、硝酸钠、硫酸钠等时，应该做校正曲线。4）其他：Folin-酚试剂法测定蛋白质含量实验耗时较长，配制溶液操作麻烦，且需要精准地控制时间，对于完成实