实验20纸层析法分析氨基酸-基础生物学实验(安徽大学研究生复试用,生物 生命科学)

实验二十纸层析法分析氨基酸一、实验目的1.掌握纸上层析的一般原理和操作方法。2.了解氨基酸的特征性颜色反应。3.学会分析未知样品的氨基酸成分。二、实验原理纸上层析法是分配层析法中的一种，常以滤纸为惰性支持物。纸上层析法是分离、鉴定和定量测定氨基酸、糖类、抗生素等有机物质的一项重要而简便的分析方法。所用设备简单、操作方便，使用样品少，分离效果好，为近代生物化学分析中重要技术之一。此法广泛地应用于科研和生产分析工作中。纸上层析的原理，常以水和有机溶剂作为展层剂；水和有机溶剂互溶后形成两个相：一个是饱和了有机溶剂后的水相，一个是饱和了水后的有机溶剂相。由于滤纸纤维素上的羟基和水分子有较大的亲和力，而与有机溶剂的亲和力相对较弱，因此我们认为水相为固定相，有机溶剂相为移动相。由于物质的极性大小不同，在两相中分配比例有所差异。极性小的物质在有机相中分配较多，随有机相移动较快；而极性大的物质在水相中分配较多，移动相对较慢，从而将极性不同的物质分开。一般来说，在相同的条件下，每种物质都有其固定的Rf值。Rf值的定义为：Rf=(原点到层析斑点中心的距离)/（原点到溶剂前沿的距离）影响Rf值的因素有：①物质本身的化学结构；②展层所用溶剂系统；③展层剂pH值；④展层时的温度；⑤展层所用滤纸；⑥展层的方向(横向，上行或下行)。用纸层析鉴定样品时，一般都与标准品相比较。若没有标准品，可选择文献记载的该物质层析条件，根据文献Rf值进行鉴定。三、实验用品1．材料氨基酸2．器材层析缸、烘箱、冷热电吹风机、毛细管、针和线、培养皿。3．试剂(1)展层剂和平衡液正丁醇：冰醋酸：水=4：1：5，充分摇匀，用分液漏斗取上层液作展层剂；下层液作平衡液。(2)样品液用水配成每ml含有苯丙氨酸、丙氨酸、组氨酸、脯氨酸各4mg的4种氨基酸溶液，以及上述4种氨基酸的混合液(各4mg／m1)。苯丙氨酸不易溶解于水，应稍微加热使之溶解。(3)茚三酮按展层剂O.25％的比例将茚三酮加入展层剂中，使其溶解。四、实验操作1．纸的处理取25cm长、15cm宽的滤纸一张，离底边2cm处用铅笔轻轻划一条与底边平行的线，并等距离的在线上定点样点(原点)划圈，使圈的直径小于0.5cm。2．点样在每个圈下用铅笔记上每种氨基的代号（混合样可写M），然后用毛细管吸取样品，轻轻地点到相应的氨基酸圈内，待晾干或用冷风吹干后再点2次。每个样品共点3次。3．饱和将点好样的滤纸纵向卷起来，点样面向里，点样点位于一端，用针线缝成筒状，不要使滤纸两边接触(见图20-1)，然后将滤纸直立于层析缸中。在层析缸内培养皿中预先放入平衡液。滤纸筒放在培养皿周围饱和1小时。4．层析图20-1滤纸的缝合将培养皿中放入2／3量的展层剂，转移到另一层析缸中。把饱和过的滤纸筒转移到此培养皿内，样品端向下垂直放置，切勿使展层剂浸到样品点。当溶剂前沿到达离上端3cm处，取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿，晾干。5．显色将晾干滤纸放入烘箱中(105℃)，烤几分钟后，滤纸上即显出氨基酸斑点。用铅笔描出斑点轮廓(见6.结果处理用尺量出原点到斑点中心距离以及原点到溶剂前沿距离，计算各标准氨基酸和混合氨基酸的Rf值。图20-2层析谱．1．原点；2．层析点；3．溶剂前沿六、实验建议(1)在整个操作过程中，手只能接触滤纸边缘，否则手指上氨基酸会造成滤纸上众多斑点。(2)在点样时，不要将毛细管插错了试剂瓶。(3)展层结束后，切勿忘记用铅笔描出溶剂前沿。(4)点样斑点不能太大（其直径应小于0.5cm），防止氨基酸斑点重复；吹风温度不宜过高，否则斑点变黄。(5)根据目的、要求，选择合适溶剂系统。七、实验报告及作业1.计算各标准氨基酸和混合氨基酸的Rf值。2.氨基酸纸上层析用哪种物质作为显色剂?这种显色剂与哪些氨基酸反应不产生蓝紫色?写出这种显色剂与氨基酸反应的反应式。3.氨基酸纸上层析的固定相和流动相各是什么？4.