基于蛋白序列的原核生物热适应机制研究

基于蛋白序列的原核生物热适应机制研究

寒热是一种复杂的综合效应，其中蛋白质分子的所有共价异质量和非共价格之差。近年来,科学家对蛋白质热稳定机制作了很多研究。而基于蛋白序列与热适应性的关系来研究热稳定性,不仅能帮助人们更好地了解超嗜热、嗜热微生物的进化和生存机制,还可以指导设计和改造蛋白质(酶)以增加它们的热稳定性,对工业应用很有好处。人们通过对超嗜热古细菌和真细菌的结构和全基因组的高通量比对分析,发现这些生物有机体都在不同程度上利用了以下2种维持热稳定的机制,并进化出了不同的热适应策略。第一种方法是基于结构和突变的策略,即通过比较低温和高温蛋白质结构的差异来分析和研究蛋白质热适应的基础,然后提出假设来指导定向突变研究,从而可以得到与蛋白热稳定有关的相互作用的详细信息。然而,目前适合用这种方法来研究的蛋白质分子数量有限,只能从其中的某一方面了解蛋白质热稳定的机制,所以这些研究之间缺少共识,因此无法找到促使嗜热蛋白与常温蛋白产生差异的基本因素。人们对于嗜热细菌及超嗜热、嗜热微生物蛋白热稳定机制的研究,大多集中在一些特定的蛋白家族。该方法研究的蛋白包括噬菌体中性蛋白酶家族、T4溶菌酶和三磷酸甘油脱氢酶。第二种方法是在高温和低温同源蛋白之间进行序列比对。在过去的研究中,由于可用于研究的低温和高温蛋白质伴有高度的序列分化而产生噪音,阻碍了这种方法的应用。直到最近一段时间,随着极端嗜热生物序列数据的积累,使用这一分析方法来研究蛋白质功能性适应机制的人逐渐增多。近年来通过对更多的基因组分析研究显示,蛋白家族的氨基酸组成与细菌的最适生长温度存在相关性。但是蛋白质组的热适应机制仍未研究透彻。因此通过研究全蛋白质组的方法,可以帮助人们认识蛋白质热适应更深层的特征。笔者详细研究了微生物蛋白质的一级结构与热稳定的关系,运用双向BLAST的方法,从526个细菌蛋白组中共识别出近4.8万种同源蛋白,然后统计出每种同源蛋白的来源菌在4个温度区间——超嗜热(hyperthermophilic)、嗜热(thermophilic)、常温(mesophilic)和嗜冷(psychrophilic)的分布情况,对分布于不同温度区间的蛋白进行综合分析。1材料和方法1.1全蛋白组序列信息从NCBIReferenceSequence数据库(/genomes/Bacteria/)下载已完成测序的846个古细菌和真细菌的全蛋白组序列信息,去除冗余的亚株类的信息,共得到526个古细菌和真细菌的序列信息。1.2根据温度分类生物,分为7类根据NCBI的基因组项目(GenomeProject)规定,统计所有微生物的最适生长温度及温度区间。按温度将生物分为5类:超嗜热生物,即生长温度在75℃以上的生物体;嗜热生物,即生物体生长温度在46～75℃;常温生物,即生物体生长温度在11～45℃;嗜冷生物,即生长温度在-1～10℃的生物体;超嗜冷生物,即生长温度在-30～2℃的生物体。1.3同源蛋白在不同温度区间的分布情况对526个细菌蛋白序列进行双序列比对,E值设定为10-10,通过最佳匹配结合细菌信息获得全部的同源蛋白。计算统计各种同源蛋白在4个温度区间的分布情况,将同源蛋白根据温度区间的划分共分成3组:HT-only、M-only和Top-90组。HT-only组是仅分布于超嗜热和嗜热温区的同源蛋白;M-only组是仅分布于常温温区的同源蛋白;Top-90组是指同源蛋白所属的细菌在各温区的分布数占该温区古细菌和真细菌数90%以上的同源蛋白。运用EMBOSS工具包中的pepstats应用程序,计算每组同源蛋白的蛋白质特性参数,如消光系数、分子量、带电量、残基数等。2结果与分析2.1同源蛋白的功能分类与功能分类通过双向BLAST比对,共得到48315种同源蛋白。其中,包含10个以上蛋白序列的同源蛋白有18042种。其中,Top-90组有115种,HT-only组有95种,M-only组有1659种。HT-only组95种同源蛋白根据同源蛋白簇(clusteroforthologousgroup,COG)的功能分类,得到属于信息存储与处理的同源蛋白共有19种,属于细胞过程与信号传导的共11种,参与代谢的8种,其中有57种同源蛋白属于未知功能。另外还发现,在19种参与信息存储与处理的同源蛋白中有6种与核糖体相关,7种属于转录调控蛋白。2.2各组cog的动力学情况由图1可知,Top-90组中50%以上的同源蛋白以及HT-only组中48%的同源蛋白参与了信息存储与处理,而这一比例在M-only组中仅占28%;参与代谢的比例在3组中较为接近,都占各组COG的30%以上;参与细胞过程与信号传导的比例在3组中略有差别,在M-only组中占的比例最大,为35%,其次是HT-only组中占20%,Top-90组中占16%。通过对3组同源蛋白的COG组成分析可知,微生物为了在高温的极端环境下维持生存,嗜热、超嗜热古细菌和真细菌的基因组进化出更多的用于信息存储与处理的功能蛋白。2.3同源蛋白的序列及分析由表1可知,HT-only和M-only2组同源蛋白某些氨基酸的组成有着显著差异。与M-only组的同源蛋白相比,HT-only组中的同源蛋白倾向于使用带电荷的(B+D+E+H+K+R+Z,28.56%对应24.05%,P<0.001)、酸性的(B+D+E+Z,13.28%对应11.28%,P<0.001)和基本的(H+K+R,15.28%对应12.77%,P<0.001)氨基酸残基。而M-only组的同源蛋白对极小(A+C+G+S+T,29.44%对应24.51%,P<0.001)和小氨基酸残基(A+B+C+D+G+N+P+S+T+V,49.49%对应44.80%,P<0.001)的使用比例明显升高。2组同源蛋白在脂肪族、芳香族、极性和非极性氨基酸残基的使用比例上差异不明显。HT-only组同源蛋白的序列长度大体上比M-only组的短,2组的平均值分别为235.66和273.58(P<0.05)。以上的性质差异都有利于嗜热、超嗜热微生物的蛋白组在高温环境下维持其热稳定性。2.4在不同温度间分布的蛋白包括蛋白平均长度、平均残基重量、各种氨基酸组成和等电点的统计。除等电点之外,所有的参数在超嗜热、嗜热和常温3个区间中的分布均差异显著(P<0.05),在嗜冷和常温2个区间的差异不显著。蛋白质序列中带电荷的、基本的和酸性的氨基酸残基的比例,在常温和嗜冷2个温度区间的蛋白显著地(P<0.05)低于超嗜热和嗜热2个温区分布的蛋白,这与HT-only组中的同源蛋白类似;而极小和小氨基酸残基的比例高于超嗜热和嗜热2个温度区间的蛋白。在不同温度区间中分布的同源蛋白的序列长度往往也有差别,生存在高温环境中的古细菌和真细菌的蛋白质序列长度一般来说较短。3高温对蛋白质氨基酸的影响蛋白质是生命的物质基础,维持着新陈代谢,在生物体内占有极其重要的地位。因此,嗜热微生物体内蛋白质的热稳定性非常值得研究。通过对526个真细菌和古细菌的全蛋白质组研究,从原核生物全蛋白序列的角度出发,证实了热稳定与氨基酸组成存在的显著相关性。超嗜热和嗜热菌中的蛋白为了适应高温的生存环境,常会使用更多带电荷的氨基酸残基,并且它们蛋白链的平均长度也远短于常温环境下的蛋白质。推测超嗜热、嗜热微生物与常温微生物蛋白质氨基酸组成的差异,可能有利于维持蛋白质在高温环境中功能的稳定性。通过对COG组成间的差异分析,发现嗜热微生物中特有的一些蛋白质在功