外排泵抑制剂的研究进展

外排泵抑制剂的研究进展

随着抗生素的广泛应用，几种抗感染药物的类型也越来越流行，抗感染疗法也面临着巨大的挑战。细菌外排作用是细菌产生耐药性的重要途径。目前已经发现了5个外排泵类型,它们是:ATP结合盒超家族(ATP-bindingcassettesuperfamily,ABC),小多重耐药家族(smallmultidrugresistancefamily,SMR),主要易化子超家族(majorfacilitatorsuperfamily,MFS),多药及毒性化合物外排家族(multidrugandtoxiccompoundextrusionfamily,MATE)和耐药节结化细胞分化家族(resistance/nodulation/celldivisionfamily,RND)。从底物特异性上看,外排泵又分为特异性外排泵和多重耐药外排泵。前者如包括肠杆菌和铜绿假单胞菌在内的多种革兰阴性菌表达的TetA-E,G,H外排泵,对四环素类抗生素有特异外排作用;后者分布更为广泛,如铜绿假单胞菌MexAB-OprM外排泵,金葡菌NorA外排泵等等。多重耐药外排泵底物谱广,并且可以外排大量的结构迥异的抗生素及其他有毒物质,例如铜绿假单胞菌MexAB-OprM外排泵的外排底物有大环内酯类、喹诺酮类、四环素类、β-内酰胺类抗生素以及氯霉素、林可霉素、新生霉素等等。多重耐药外排泵广泛存在于各种病原菌中,对细菌的药物敏感性以及细菌性感染的临床治疗影响很大。例如过量表达MexAB-OprM外排蛋白的铜绿假单胞菌菌株比MexAB-OprM的基因敲除菌株的左氧氟沙星MIC高64倍,临床分离的高表达NorA外排泵的金葡菌株较野生菌株对诺氟沙星和环丙沙星MIC分别提高了16倍和8～16倍。同时,外排泵的存在降低了胞内抗生素浓度,低浓度抗生素环境中易产生耐药突变株。目前已经发现了一些具有细菌外排泵抑制活性的化合物,但目前还没有一种能够用于临床治疗,外排泵抑制剂类药物的研发工作任重而道远。本文概述了迄今发现的具有细菌多重耐药外排泵抑制活性的化合物以及它们的作用特点。1外排泵acrab-tolc组件的acra-a/lspa的表达Globomycin是一种链霉菌来源的环肽结构的抗生素,它是脂蛋白信号肽酶LspA的抑制剂,通过抑制LspA从而抑制含有LspA剪接位点的膜融合脂蛋白前体的加工。大肠埃希菌(Escherichiacoli)和产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)组成性表达RND型外排泵AcrAB-TolC的组件AcrA前体含有LspA的剪接位点,在globomycin的作用下不能形成成熟的AcrA,也不能和外排泵的其他组分结合形成外排泵,抑制了外排泵的作用。文献报道75μmol/Lglobo-mycin能够使表达AcrAB-TolC的产气肠杆菌的氯霉素MIC降低至原值的1/4,其外排泵抑制能力与CCCP(100μmol/L)相同,低于PAβN(100μmol/L,MIC降低至原值的1/8)。2外排泵抑制剂研究分析除ABC型外排泵是依赖ATP水解驱动外,其余四种外排泵SMR、MFS、MATE和RND均由质子动力势驱动。对细菌多重耐药外排泵抑制剂的研究发现,以阻断外排泵能量来源为机制的外排泵抑制剂主要针对质子动力势,按照作用机制又分为解偶联剂和离子载体两种类型。这类抑制剂在抑制细菌外排泵的同时也会抑制机体正常的质子动力势驱动的生理反应,缺乏特异性,因此难以用于临床治疗。2.1偶联剂(1)cccp外排泵抑制剂羰基-氰-间-氯苯腙(carbonylcyanidem-chlorophenylhydrazone,CCCP)。分子解离状态下,负电荷分布于分子中的多个原子,分子周围的电场很弱,可在磷脂膜两侧自由扩散,传递质子以破坏跨膜电化学梯度,因此它是很强的解偶联剂。CCCP作为外排泵抑制剂对SMR型外排泵(如大肠埃希菌QacE)、MFS型外排泵(如金葡菌NorA)、MATE型外排泵(如多形拟杆菌NorM)和RND型外排泵(如铜绿假单胞菌MexAB-OprM,大肠埃希菌AcrAB和AcrEF,产气肠杆菌AcrAB-TolC,空肠弯曲杆菌CmeABC)等均有抑制作用。例如,100μmol/L的CCCP可以使表达AcrAB-TolC的产气肠杆菌的氯霉素MIC降低至原值的1/4。(2)nora抑制活性兰索拉唑(lansoprazole)和奥美拉唑(omeprazole)临床上用于治疗消化性溃疡。已证明它们可以抑制金葡菌NorA外排泵,在100μg/ml浓度下可使NorA高表达株的诺氟沙星、环丙沙星和左氧氟沙星MIC降低至原值的1/4～1/8,推测其机制与CCCP相似。此外,兰索拉唑还可以抑制和NorA同源的粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)EmeA外排泵。2.2干扰跨膜电化学杂质梯度由链霉菌产生的valinomycin和nigericin均为钾离子载体。Valinomycin能与K+配位结合形成脂溶性复合物,穿过质膜,将膜外K+运送到膜内,从而破坏膜电位Δψ。Nigericin可以使H+和K+交换,破坏pH梯度。两者均可以干扰跨膜电化学质子梯度,抑制外排泵。文献报道它们可以抑制金葡菌QacA外排泵,在4μmol/L浓度下使细胞内乙啡啶的积累量提高约3倍,它们还可以抑制肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)对氟喹诺酮类等化合物的外排泵。3外排泵通道外排泵抑制剂的故障3.1共生体外排泵整合剂为复合生物二胺类化合物L-Phe-L-Arg-β-naphthylamine(PAβN,即MC-207110)是发现最早的铜绿假单胞菌MexAB-OprM、MexCD-OprJ和MexEF-OprN等RND型外排泵抑制剂,40μg/ml的PAβN可将上述三种外排泵高表达株的左氧氟沙星MIC降低至原值的1/60,其机制是结合外排泵相应位点以阻止其他底物与该位点的结合。PAβN除了能抑制铜绿假单胞菌RND型外排泵,还可抑制其他一些革兰阴性菌的RND型外排泵,如沙门菌属AcrAB、大肠埃希菌、产气肠杆菌AcrAB-TolC等。当然,并非所有革兰阴性菌的RND型外排泵都可以受到PAβN的抑制,例如其不能抑制类鼻疽伯克菌(Burkholderiapseudomallei)的RND型外排泵,也不能抑制嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)的SmeDEF外排泵对环丙沙星和四环素的外排作用,甚至还会增加铜绿假单胞菌MexXY-OprM外排泵对氨基糖苷类药物的外排作用,其确切的作用机制有待证明。D-Orn-D-hPhe-3-aminoquinoline(MC-02595)是另一种具有抑制铜绿假单胞菌RND型外排泵活性的二胺类化合物,活性和PAβN相似,在5～10μg/ml均可以使左氧氟沙星MIC降低至原值的1/8倍,但是这两种二胺类化合物对小鼠表现出明显的毒性,因此不能直接用于临床治疗。经过结构优化,获得了诸如MC-04124的活性不减,毒性更小(毒性降至原值的1/4以下)的化合物。对MC-04124已经进行了小鼠急毒和大鼠药动学试验,但未见后续研究报道。某些喹啉(quinoline)衍生物对产气肠杆菌和肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)临床分离株的AcrAB-TolC外排泵具有抑制活性,如某些喹啉的吡啶、烷氧氨基、烷氧基和硫代烷氧基衍生物。通过构效关系研究推测这类衍生物的作用机制可能是结合或者遮盖外排泵中的底物结合位点,阻止底物的运输。目前未见关于此类化合物的临床研究报道。3.2多重耐药外排泵利血平(reserpine)是一种生物碱,临床上用于治疗高血压。从目前报道显示,利血平对于MFS以及ABC型外排泵具有抑制作用。Ahmed等通过特定位点氨基酸取代推测出了利血平在枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)Bmr外排泵上的结合位点,其作用机制为竞争性抑制。已有的报道证明利血平可以抑制多种多重耐药外排泵,如MFS型外排泵枯草芽孢杆菌Bmr、金葡菌NorA、肺炎链球菌PmrA以及ABC型外排泵粪肠球菌EfrAB、Non-O1霍乱弧菌VcaM等[28,30,31,32,33,34]。利血平活性良好,20μg/ml浓度时可以使表达NorA外排泵的金葡菌诺氟沙星MIC降低至原值的1/16。然而对于人体而言,它实现外排泵抑制活性所需要的浓度可导致神经毒性,因此未能直接用于临床治疗。维拉帕米(verapamil)在临床上属于IV类抗心律失常药,为钙离子内流阻滞剂。对维拉帕米抑制P-糖蛋白(P-glycoprotein)的研究表明,维拉帕米与外排泵有相应的结合位点。文献报道其可以抑制多种MFS型(如粪肠球菌EmeA和金葡菌NorA)及ABC型(如粪肠球菌EfrAB,结核分枝杆菌DrrAB、Rv2686c-Rv2687c-Rv2688c)外排泵[4,11,28,32,36,37]。100μg/ml维拉帕米可以使表达NorA外排泵的金葡菌诺氟沙星MIC降低至原值的1/4,但目前未见将对其进行临床研究的报道。4外排泵的组成与未知的外排泵选集有关这类抑制剂机制尚未明确,也没有用于临床研究的报道(图3)。4.1小属植物poled菌的合成一些黄酮类化合物能够抑制金葡菌NorA外排泵的活性,如小檗属植物中的黄酮木脂素类化合物5′-methoxyhydnocarpin-D,植物Daleaversicolor的代谢产物4′,6′-dihydroxy-3′,5′-dimethyl-2′-methoxychalcon,从老鹳草属植物Geraniumcaespitosum中提取的一些polyacylatedneohesperidosides,以及天然产物epicatechingallate和epigallocatechingallate。能够抑制金葡菌NorA外排泵的还有从麻风树属植物Jatrophaelliptica中提取的生物碱2,6-dimethyl-4-phenylpyridine-3,5-dicarboxylicaciddiethylester,来源于小檗属植物的卟啉类化合物脱镁叶绿甲酯酸A(pheophorbidA),以及从迷迭香属植物迷迭香中提取的松香烷二萜类化合物鼠尾草酸(carnosicacid)。另外Daleaversicolor的代谢产物3,5,4′-trimethoxy-trans-stilbene可以抑制蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)的外排泵。4.2外排泵抑制剂的筛选某些芳基哌嗪类化合物(arylpiperazines)被证明具有抑制大肠埃希菌RND型外排泵AcrAB和AcrEF的活性,其机制尚未明确。在最近报道中发现1-(1-naphthylmethyl)-piperazine还可以抑制弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)、产气肠杆菌、肺炎克雷伯菌等临床分离株的外排泵。InfluxInc.经过对9600种结构各异的化合物进行筛选,发现了数种金葡菌NorA外排泵抑制剂。这些抑制剂提高环丙沙星活性的能力超过了利血平,但是它们的机制均未研究清楚。4.3金葡菌nora外排泵吩塞秦(phenothiazine)、噻吨类药物(thioxanthene)为多巴胺受体拮抗剂和钙调素抑制剂,临床上作为安定药和止吐药。研究证明这两类药物(如氯丙嗪、氟奋乃静、丙氯拉嗪、顺式-和反式-氟哌噻吨)能够抑制金葡菌NorA外排泵。尽管已经证明这些物质具有破坏质子动力势的能力,但试验推测这并不是这些物质外排泵抑制作用的主要机制,主要机制可能是与外排泵直接作用等其他机制。另据最新报道,吩塞秦类药物硫利达嗪(thioridazine)也