穗花杉组培快繁技术研究

穗花杉组培快繁技术研究

根据刘克旺和孙同兴的研究，绥化山红杉是第三系残留植物，雌性和少雄性。果实量小，不稳定，分为大、小、小的不同年份。种子期长，幼苗容易干燥，整个植物死亡。高繁育效率低。根据严格的栖息地条件和严重的人为破坏，我们研究了绥化山的有效繁殖方法。如果我们能通过小规模的修剪来生长绥化山，有效的快速栽培，对于保护珍稀穗花杉的群落非常重要。从1998年10月到2001年3月，将杆段作为室外植物进行了无菌组织培训试验，并取得了初步成效。1材料和方法1.1材料表面从保护区移入苗圃的穗花杉实生苗,取茎段进行组织培养;当年发芽苗,取嫩茎试验.1.2方法1.2.1带节茎段作外植体接种4月下旬～11月上旬,采集嫩枝,自来水及洗涤液处理过后,切分成约0.8～1cm的带节茎段作外植体接种.因红豆杉科植物组培污染和褐化是大问题,试验采用了KMnO4、70%酒精、0.1%升汞3种药品不同处理时间共9组合进行正交试验,对茎段进行综合消毒处理.每组20瓶培养基进行比较试验,培养30d后记载污染数、褐化数、存活数.1.2.2水株或6-baba、kt、u3000添加不同浓度的激素基本培养基有1/2MS和MB共2种,添加蔗糖前者为2.5g/100g,后者为2.0g/100g,琼脂0.8g/100g,pH值5.8,活性炭0.3g/100g,并附加不同浓度的激素,如NAA、6-BA(BA)、ZT、KT、IBA等.128℃高温蒸气灭菌15min.1.2.3诱导诱导试验培养基为1/2MS(基)+蔗糖2.5g/100g+琼脂0.8g/100g+活性炭0.3g/100g+BA3mg/L+NAA2mg/L,依不同温度(21、25℃)及光照(明、暗)情况分4组交叉试验.30d后观察愈伤组织诱导情况,50d后观察腋芽诱导情况.1.2.4激素配比对高校说利用中南林学院重点实验室的设备进行穗花杉茎段腋芽的诱导,每瓶培养基接1个茎段,温度(25±1)℃,光照人为控制进行对照实验.采用带节茎段,经不同激素配比的组合实验,1～2次转接后,诱导腋芽萌发.基本培养基有两种:一种为MB,附加激素NAA4水平和KT3水平,采用全面试验法;另一种为1/2MS,附加活性炭,NAA、BA、KT3激素3水平采用正交试验法,进行腋芽诱导试验.1.2.5试苗带节茎段培养诱导出的腋芽苗转入壮苗培养基,一部分待苗长至2cm长以后,切取试管苗带节茎段,循环取材再培养,诱导腋芽,一部分则诱导不定根.采用1/2MS基本培养基,3种配方:壮1加NAA0.1mg/L;壮2加IBA0.1mg/L;壮3为基本培养基.记录发叶数和茎的长度.1.2.6植物激素的诱导待壮苗培养基中的苗长至8片叶以上,若高度不及2cm,茎较粗,基部有大团愈伤组织,即可转移到含不同植物激素IBA、NAA、KT、ZT的1/4MS培养基(MS大量元素减为1/4,其它减为1/2),附加蔗糖2.0%、琼脂0.8%、pH值5.8,诱导不定根.2结果与分析2.1污染情况对土壤污染率的影响处理30d后,20瓶中有部分外植体污染,没有污染的也有部分褐化,存活下来的一部分产生愈伤组织,一部分基本无变化,一部分节上膨大,可望产生腋芽.具体处理方法及结果见表1.从表1可知,控制污染效果较好的有组合2(KMnO40.1%处理5min+70%酒精处理0.5min+0.1%升汞处理10min)和组合5(KMnO40.1%处理8min+70%酒精处理30s+0.1%升汞处理15min),污染率皆为30%,但后者褐化较严重;防止褐化效果最好的有组合1(KMnO40.1%处理5min+70%酒精处理0.1min+0.1%升汞处理5min),但是污染率较高;综合污染数和褐化数分析存活率,材料最佳处理方法为组合2,外植体存活率为40%.2.2对愈伤组织和腋芽的诱导效果不同温度及光照培养30d愈伤组织情况、50d腋芽诱导情况见表2.从表2可知,不同温度(21、25℃)对愈伤组织和腋芽的诱导效果有差异,其中21℃对于茎段愈伤组织的发生率更高些,而25℃下培养有利于诱导腋芽发生;光照下愈伤组织略比暗培养下易发生,但对腋芽诱导没有明显影响.故在穗花杉组织培养中重点要注意温度,光照可以不用考虑.2.3腋芽诱导试验在芽的诱导过程中成功分化了腋芽.组别1～12采用MB基本培养基,附加不同激素;组别13～21采用1/2MS基本培养基,附加不同激素,进行腋芽诱导试验,结果见表3、图1.表3中组合22～25表明,仅用生长素和细胞分裂素单独进行诱导都是难以成功的;组合1～12说明,腋芽诱导以MB基本培养基+NAA0.5mg/L+KT1.5mg/L为最适,成功率为60%(第6组);1/2MS基本培养基+BA3.0mg/L+NAA2.0mg/L+KT0.5mg/L+活性炭0.3%(第18组)效果也较好,腋芽诱导率为50%.2.4激素对乳苗中、苗茎生长的影响腋芽初步诱导出来后,似绿豆大小突起,在原培养基上生长缓慢,故转至壮苗培养基,促进腋芽生长,利于生根.进行此项试验时,共有无污染腋芽84瓶,每组合都试验28瓶,每瓶23～24mL.培养结果见表4.从表4可知,附加激素IBA0.1mg/L的壮苗培养基壮2上生长的试管苗发叶最多,而不加任何激素的培养基壮3上生长的试管苗茎伸长最多.若想扩大繁殖系数,循环取材,可将腋芽苗转接入不加激素的培养基中促其茎伸长,长至2cm以后,可切除上半部约1cm茎段转接到腋芽诱导培养基中,使之芽生芽或“以芽还芽”;若直接促其生根,则先将其转入附加IBA0.1mg/L的壮苗培养基壮2上促进发叶、强壮,而后转入生根培养基.2.5穗花杉试管苗的生根共28瓶,转入生根培养基.添加激素IBA、NAA、KT、ZT.结果见表5、图2.从表5可知,穗花杉试管苗在适当的生长素配比下(IBA4mg/L+NAA2mg/L)可以生根,而且根生长良好,培养基中不宜加入分裂素.实验中,根是在愈伤组织团上形成,属于不定根.这是裸子植物组织培养上的一项成果,也是珍稀保护植物种质资源保存的一项成果.3诱导腋芽发生(1)腋芽分化的最适培养基为MB(1/2MS+B5)+KT1.5mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖2.0%+琼脂0.8%,腋芽诱导率可达60%.培养基1/2MS+6-BA3.0mg/L+NAA2.0mg/L+KT0.5mg/L+活性炭0.3%+蔗糖2.5%+琼脂0.8%效果也不错,腋芽发生率可达50%.(2)最适试管苗发叶壮苗培养基为1/2MS+IBA0.1mg/L+琼脂0.8%+蔗糖2.0%.不加任何激素的1/2MS培养基上生长的试管苗茎伸长最多.若要诱导生根,可采用前者;若想循环取材繁殖,可以采用后者.(3)成功诱导不定根的培养基为1/4MS+IBA4mg/L+NAA2mg/L+琼脂0.8%+蔗糖2.0%.(4)材料最佳处理组合为KMnO40.1%处理5min+70%酒精处理0.5min+0.1%升汞处理10min.在2