穗花杉随机扩增多态性dna条件优化

穗花杉随机扩增多态性dna条件优化

穗花杉是红杉科的一种植物。这是中国特有的国家保护植物和第三个世纪的遗迹。它对研究中国南方植物区系的产生和发展具有重要的价值。由于穗花杉形状独特，生长优美，种子成熟，有鲜红色的假种皮，材料优良，因此可以作为优良的园林观赏树种和材料树种。随机扩增多态DNA(RandomamplifiedpolymirphismDNA,RAPD)分析是建立在PCR反应基础上的一种的分子生物学技术,它具有引物可以随机设计、所需DNA量少、操作技术简单、快速等优点,近年来已被广泛应用于分析物种的遗传多样性.但由于其重复性、稳定性较差,因此必须对其扩增反应条件进行优化.本实验对穗花杉RAPD反应条件进行了优化,旨在为后续遗传多样性的分析建立一个最优的RAPD扩增体系.1材料和方法1.1试验材料实验用穗花杉叶片采自江西宜丰官山.采后立即冰冻,带回实验室洗净、晾干后置于-70℃超低温冰箱中保存备用.1.2pcr和upv-80凝胶成像系统TaqDNA聚合酶购自TaKaRa公司,Mg2+、dNTPs、随机引物、λDNA/HindIII+EcorRIMarker和GeneRuler/100bpDNALadderPlusMarker均购自上海生工公司;PCR仪为PTC-200型(美国MJResearch公司);电泳仪及电泳槽均由北京六一厂生产;UPV-8000凝胶成像系统为Ultra-VioletProductsLtd生产;2000型&UV-型分光光度计为尤尼柯(上海)仪器有限公司生产.1.3dna纯度和含量的测定DNA的制备与定量参照CTAB改良法,称0.125g新鲜叶片,用液氮研磨成粉状,转入1.5mL离心管中.加入1mL、-20℃的丙酮,轻轻震荡1min后于5000rpm离心10min,去上清后再重复上述丙酮处理一次.向管中加入预热60℃的CTAB1mL,60℃温育4h,后加入500μL氯仿∶异戊醇(24∶1),抽提10min后以13000rpm离心10min,取上清重复上述抽提直至不见蛋白沉淀.取上清加入2/3体积的冷异丙醇,轻轻混匀后,于2000～3000rpm离心3min.沉淀用70%的乙醇在室温洗涤20min后,1000rpm离心10min.沉淀于室温干燥后用50μLTE缓冲液溶解.采用紫外可见分光光度计测定DNA纯度和含量.1.4rapd反应条件设置本实验选用引物S41(ACCGCGAAGG)对各反应因素进行优化.(1)模板DNA含量对RAPD扩增反应的影响:实验中设置模板含量梯度分别为15,25,35,50,70,100,130ng.(2)TaqDNA聚合酶含量对RAPD扩增反应的影响:实验中设置酶含量梯度分别为0.5,0.8,1.0,1.5,2.0,2.5U.(3)Mg2+浓度对RAPD扩增反应的影响:实验中设置Mg2+浓度梯度分别为1.0,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0mmol/L.(4)dNTP浓度对RAPD扩增反应的影响:实验中设置dNTP的浓度梯度分别为0.15,0.20,0.25,0.30,0.35mmol/L.(5)引物浓度对RAPD扩增反应的影响:实验中设置引物浓度梯度分别为0.15,0.30,0.45,0.60,0.75,0.90μmol/L.以上除扩增反应变量外,其余试剂的用量及反应条件为:模板量70ng、2×Taq酶buffer2μL,0.2mmol/LdNTP、2.5mmol/LMg2+浓度、1.5UTaq酶、0.45μmol/L引物.扩增反应完成后,取10μL的产物在1.4%的琼脂糖凝胶上,1×TBE缓冲液中电泳,稳压电泳2h左右,Marker作分子量标准,用凝胶成相仪拍照检测.2结果与分析2.1种方法所提基因组dna含量和纯度DNA的检测用改良CTAB对穗花杉基因组进行提取,经电泳分析显示其大小为23kb左右(图1,M为标准分子量参照物,以下同).通过紫外分光光度计测定基因组DNA含量和纯度.本实验对比了几种处理方法对基因组DNA提取的影响,结果表明:与未用丙酮进行前处理相比,提取穗花杉基因组DNA采用丙酮前处理去除色素,所得提取产物基因组DNA物纯度较高,故在提取基因组DNA前用丙酮进行处理.同时研究表明,在2～4h范围内,CTAB抽提时间的长短对提取的基因组DNA产量和纯度影响不大.2.2pcr扩增结果RAPD扩增反应的影响据文献报道,在RAPD分析时,不同植物所需的模板DNA量各不相同.为确定穗花杉RAPD扩增反应所需最适模板DNA量,本实验共设置了7个模板DNA含量梯度进行优化.由PCR扩增结果可知(图2),在模板含量为15ng和25ng时,电泳图谱未见有扩增条带.在35,50,70ng时,电泳图谱可见清晰稳定的扩增条带.随着模板DNA量继续增加,电泳图谱上扩增条带弥散不清晰.一般认为模板浓度在一定范围内不会影响扩增条带的数量,即不会导致扩增位点的增减,但对扩增产量有影响,本实验结果与此一致.因此根据上述结果,确定穗花杉RAPD反应采用50～70ng的模板即可.2.3电泳带型的表征RAPD扩增产物的质和量与TaqDNA聚合酶的含量密切相关,酶含量的高低直接影响扩增反应的效果.TaqDNA聚合酶含量过高时会有小片段产生,从而使电泳带型呈现弥散状态,背景非常严重;TaqDNA聚合酶含量过低则导致扩增条带太弱.在本实验中,当酶含量为0.5U,电泳图谱上没出现扩增产物条带;在0.8～2.5U,电泳图谱上扩增产物条带稳定,清晰;随着酶浓度的增加,电泳图谱上扩增产物条带数不清晰(图3).从实验效果及节约实验费用的角度考虑,穗花杉RAPD反应体系宜采用酶含量为1.5U.2.4mg2+对taqcda聚合酶的影响在本实验中,Mg2+浓度在1.0～2.5mmol/L时,电泳图谱上扩增产物条带清晰且稳定,但在2.0mmol/L扩增产量最大.随着Mg2+浓度的增大,扩增产物量较少(图4).产生此现象的原因可能为:(1)Mg2+是TaqDNA聚合酶的激活剂,其浓度的变化将影响酶活性,在Mg2+的浓度较低时,Taq酶可结合的游离Mg2+相对来说较少,酶活力较低,因而扩增反应的产物较少.(2)Mg2+可和RAPD扩增反应混合物中DNA模板、引物和dNTP的磷酸基团相结合,当Mg2+浓度高到一定程度时,会拮抗dNTP和模板的有效含量,最终影响扩增结果.2.5dntp浓度对扩增条带的影响dNTP作为PCR反应的原料,其浓度的大小直接影响扩增反应的产量和稳定性.在0.15～0.25mmol/L时,扩增产物量较高,可见明显的扩增条带,这与一般文献报道的dNTP适宜浓度为0.20mmol/L相一致.随着dNTP浓度增加,条带模糊不清.产生此现象的原因可能为:dNTP是反应中磷酸的主要来源,能与镁离子相结合.当dNTP浓度较低时,由于与镁离子的结合而使其本身有效浓度更低,导致扩增量减少;当dNTP浓度较高时,dNTP与镁离子相结合又会降低反应液中游离镁离子的浓度,从而影响酶的有效活力.本实验确定dNTP浓度为0.25mmol/L.2.6引物浓度对非特异性pcr扩增的影响设置6个引物浓度梯度进行了分析(图6).当引物浓度较低时,扩增产物量少;在0.30～0.60μmol/L时带型清晰,背景较浅;随着引物浓度的增加,非特异性扩增表现非常明显,电泳条带变得模糊.这是因为引物浓度过低,无法与所有的模板DNA结合位点结合,导致扩增结果不理想;引物浓度过高时,会促使引物错误地引导非特异性产物的合成,非特异性产物和引物二聚体均为PCR反应的底物,与靶序列竞争DNA聚合酶和底物dNTP,均使靶序列扩增量降低,而出现非特异条带.本实验确定引物浓度应采用0.60μmol/L.2.7预变性时间的确定RAPD扩增反应的影响(1)退火温度对RAPD扩增反应的影响:本实验对RAPD扩增反应中的退火温度进行了优化,设置了4种退火温度(分别为33,35,37和40℃).只有在37℃时扩增产物条带稳定而清晰、重复性好.33℃和35℃时,扩增产物条带模糊不清,产量也低(图7).当退火温度为40℃,电泳图谱上基本不见扩增产物条带.因此确定退火温度为37℃.(2)预变性时间对RAPD扩增反应的影响:本实验对模板DNA扩增前的预变性时间也设置了梯度比较,在94℃条件下,对模板预变性时间处理1,2,3,4,5和6min,扩增效果见图8.模板预变性时间为4～5min时,扩增产物电泳条带清晰明亮.模板预变性时间为6min时,扩增产物电泳条带缺失,可能由于高温时间过长,TaqDNA聚合酶的活性造成损失.本实验确定预变性时间为5min.2.8穗花杉rapd最佳扩增程序在以上优化的条件下,本实验利用6个样本对引物S40～S160共120条引物进行了筛选.其中引物S41、S42、S59、S60、S67、S68、S77、S91、S92、S99、S100、S102、S103、S104、S110、S111、S114、S126、S136、S137等引物扩增结果表现出较丰富的多态性,带型