坐骨神经切断术大鼠骨组织结构改变的动物实验研究

坐骨神经切断术大鼠骨组织结构改变的动物实验研究

废除骨松解是一种机械应力减少导致局部或整体骨失去和骨重减轻的局部或整体骨松解。2011年6—10月本实验通过建立大鼠废用性骨质疏松模型,在造模后不同时间段对其血、尿生化水平变化,骨组织形态学检测方面进行评价,为进一步动物实验和临床研究提供实验依据。1模型的制作与分组1.1实验动物3月龄SD大鼠78只,体重(283.5±41.7)g,雌雄不限,由江苏大学实验动物中心提供。动物合格证:SCXK(苏2009-0002),发证机关是江苏省实验动物管理委员会。1.2饲养环境及分组在动物实验室适应性喂养1周,再按照体重排序后,将其中72只大鼠按随机数字表分为两组,即假手术组(SO组)和模型组(M组),每组36只,每组又根据术后第1、2、4、6、8、12周的不同时段分为6个亚组,每组6只。另6只作为空白对照组(BC组)饲养3个月。精饲料喂养,自由饮用自来水,切口保持干洁,定期碘伏消毒。1.3模型制作M组行左后肢坐骨神经切断术,SO组的手术过程只分离显露坐骨神经后缝合切口,BC组不作任何处理。1.4检测项目与方法1.4.1标本的获取M组和SO组分别在术后第1、2、4、6、8、12周各随机取6只大鼠收集晨尿。处死解剖后心脏穿刺抽取血液0.5~1mL,注入离心管,在室温下静置2h后,于低速离心机离心,速度3000r/min,离心5min,留取血清,置冰箱内-20℃冷冻保存。1.4.2骨代谢生化指标的测定使用全自动生化分析仪测定尿肌酐(Cr)、血碱性磷酸酶(ALP),尿羟脯氨酸(HOP)用对二甲氨苯甲醛法测定,血清骨钙素(BGP)用放射免疫法测定,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)用免疫酶联法。1.4.3胫骨组织形态学检测取各组左胫骨近侧干骺段,甲醛固定,EDTA液脱钙,冠状对剖,酒精顺浓度梯度脱水,组织浸蜡,石蜡包埋,5μm切片,HE染色和Masson染色,镜下观察股骨远侧干骺端骨组织形态改变。1.5统计学方法采用SPSS11.5统计软件,所有数据行正态分布检验,呈正态分布数据以x¯±sx¯±s表示。多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD分析,两组间比较采用t检验。2结果2.1手术切口红外观大鼠实验中无动物意外死亡,观察各时间段内大鼠体重增长基本正常。部分大鼠手术切口红肿,经消毒等处理后愈合良好。M组大鼠造模后即出现患肢跛行,至处死仍不能恢复,但均可以3个肢体行走及正常觅食。SO组术后1周内即可恢复4个肢体行走及正常觅食。2.2不同时期血alp、bgs、trach和尿丙酮值的测定结果2.2.1各组小鼠血alp比较随着去神经时间的延长,M组血ALP逐渐升高,至第8、12周这种升高趋势变缓。M组各时段之间血ALP差异有统计学意义(P<0.05),M组与BC组间血ALP差异有统计学意义(P<0.05),SO组与BC组间及SO组内各时段之间血ALP差异无统计学意义(P>0.05)。第1周M组与SO组间血ALP差异无统计学意义(P>0.05),余各时段M组与SO组间血ALP差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。2.2.2各组各时段之间血bgp的比较随着去神经时间的延长,M组血BGP逐渐降低,至第8、12周这种降低趋势变缓。M组血BGP术后1、2周与其他时段之间差异有统计学意义(P<0.05),术后4、6、8、12周之间血BGP差异无统计学意义(P>0.05),M组与BC组间血BGP差异有统计学意义(P<0.01),SO组与BC组间及SO组各时间段之间血BGP差异无统计学意义(P>0.05)。各时间段M组与SO组间血BGP差异均有统计学意义(P<0.01)。见表2。2.2.3各组血tracp比较随着去神经时间的延长,M组血TRACP逐渐升高,至第8、12周这种升高趋势变缓。M组各时段之间血TRACP差异有统计学意义(P<0.05),M组与BC组间血TRACP差异有统计学意义(P<0.05),SO组与BC组间及SO组各时段之间血TRACP差异无统计学意义(P>0.05)。各时段M组与SO组间血TRACP差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。2.2.4各组间尿hop/cr的比较随着去神经时间的延长,M组尿HOP/Cr逐渐升高,至第8、12周这种升高趋势变缓。M组各时段之间尿HOP/Cr差异有统计学意义(P<0.01),M组与BC组间尿HOP/Cr差异有统计学意义(P<0.05),SO组与BC组间及SO组各时段之间尿HOP/Cr差异无统计学意义(P>0.05)。第1、2周M组与SO组尿HOP/Cr差异无统计学意义(P>0.05),余各时段M组与SO组间尿HOP/Cr差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4。2.3骨皮质与so组观察的稳定性观察SO组胫骨近侧干骺段骨皮质较厚,孔隙较少,骨小梁排列紧密,结构正常,见图1。而M组骨皮质与SO组相比较薄,孔隙增多,骨小梁稀疏、纤细并有多处断裂,小梁间吻合减少,骺板下区空旷,髓腔扩大,破骨细胞数增多,且随着观察时间延长,表现越明显,见图2。新生成的胶原经Masson染色为绿色,可见随着废用时间的延长,新生胶原的量也在减少,见图3。3骨组织模型的建立废用性骨质疏松是由于各种原因导致肢体制动、全身不活动或者失重以后,体内骨形成和骨吸收的平衡被打乱,成骨细胞介导的新骨形成减低,而破骨细胞介导的骨吸收增强,导致局部性或者全身性骨量减低和骨的力学性能显著降低,患者的骨折发生率显著增高。骨形成的指标有血清总ALP和BGP,骨吸收的指标有TRACP和尿HOP/Cr。当骨形成与骨吸收偶联时,BGP是反映骨转换的指标,而当骨形成与骨吸收解偶联时,BGP是反映骨形成的特异指标,BGP作为直接反映骨形成的特异性指标,可用来监测骨质疏松和判断其他代谢性骨病治疗效果。血清ALP包括总ALP和骨ALP,在没有肝脏疾病的情况下,血中ALP含量的变化大致反映骨代谢变化的程度,但对骨组织而言缺乏特异性。骨源性酸性磷酸酶能抵抗酒石酸的抑制,故而称之为TRACP,血液TRACP主要来源于骨吸收过程中破骨细胞的释放,TRACP的活性与骨吸收状况相平行。尿HOP主要反映骨组织胶原代谢的变化,在无明显的皮肤疾病和其他结缔组织疾病时,尿HOP在很大程度上反映骨代谢的改变,研究表明,尿HOR/Cr比值与骨吸收呈显著正相关,可以将尿HOR/Cr比值的水平作为衡量骨有机质吸收的重要生化指标。本实验中,造模术后各时间M型组直接反映骨形成的特异性指标BGP显著性降低,反映骨内胶原代谢变化的指标HOP/Cr显著性增加,血清ALP显著升高,一定程度上揭示骨转换率及骨形成明显增加,血清TRACP显著升高,标志着骨吸收增加。骨组织形态学观察发现M组骨皮质与SO组相比较薄,孔隙增多,骨小梁稀疏、纤细并有多处断裂,小梁间吻合减少,骺板下区空旷,髓腔扩大,破骨细胞数增多,新生胶原的量也在减少,且随着观察时间延长,表现越明显。这些指标的改变表明废用性骨质疏松的大鼠模型建立成功。目前复制废用性骨质疏松动物模型所采用的动物和方法较多,其中以大白鼠最为常用,BARON等认为,12周左右的大鼠其二级松质骨的重建酷似人类骨骼,因此以研究人类为目的而以大鼠为实验模型是可行的。与其他模型比较,失神经引起的局部骨质疏松在本质上更接近于临床上所见到的废用性骨质疏松。但查阅文献,发现采用大鼠失神经造模后发生废用性骨质疏松的时间段并不一致,以及通过此造模方法观察废用性骨质疏松最佳时间段未见相关报道。ZENG等报道失神经后骨形成下降,骨吸收增加,骨丢失在术后10~42d达高峰,并在X线片上有反映。SHVETS等将体重为200~230g的Wistar雄性大鼠限制于小型笼具内60d诱发骨质疏松。TUUKKONEN等应用石膏固定重200gSD雄性大鼠的单侧后肢2周,发现被固定测胫骨的灰重丢失10.7%,同时钙与骨的结合被显著抑制,血清ALP的活性明显降低。唐学阳等将4周龄SD雄性大鼠通过腿-尾固定法制动2周和4周后发现股骨湿重、灰重、股骨和胫骨骨密度均显著低于对照组,胫骨近侧干骺端骨组织成骨细胞胞浆和核膜维生素D表达,制动后表达增强。大鼠后肢制动2周后,右后肢胫骨近侧干骺端的骨小梁面积约为同龄对照组的68.2%,骨小梁周长约为同龄对照组的76.8%;在制动4周后,右后肢胫骨近侧干骺端的骨小梁面积仅约为同龄对照组的28.8%,骨小梁周长则约为同龄对照组的39.4%,与制动2周时相比,随着制动时间的延长,两者均有明显下降。本研究中,M组术后1、2周与其他时段之间血BGP差异有统计学意义(P<0.05),术后4、6、8、12周之间血BGP差异无统计学意义(P>0.05);且从术后第4周开始