第九章 DNA重组与遗传转化

第九章DNA重组与遗传转化

本章重点：内切酶、基因克隆、遗传转化。本章难点：酶切片段的多态性、基因的重组。1概述一、重组DNA技术的建立

1971年，Smith等人从细菌中分离出的一种限制性酶，酶切病毒DNA分子，标志着DNA重组时代的开始。

1972年，Berg等用限制性酶分别酶切猿猴病毒SV40和λ噬菌体DNA，将两种DNA分子用连接酶连接起来得到新的重组DNA分子。

1973年，

Cohen和Boyer等(美国斯坦福大学)进一步将酶切后的DNA分子与质粒DNA连接起来，即将大肠杆菌R6-5质粒DNA（含卡那霉素抗性基因）和大肠杆菌pSC101质粒DNA（含四环素素抗性基因）重组后转化大肠杆菌，并将重组质粒转入E.cloi细胞中，产生同时表现出两种抗性的细菌。

Berg、Cohen和Boyer等人的工作是世界上第一次实现DNA体外重组，建立了第一个基因克隆系统（质粒—大肠杆菌），导致了一个全新的生物技术学科和产业即基因工程的诞生。2二、基因工程发展和应用

基因工程的诞生打破了物种的界限，实现了物种间的基因交流，在实验室里对生物直接进行改造，为生命科学的研究开辟了新的领域、注入了新的方法，为提高人类的生活质量和健康水平开辟了新的途径，在农业、工业、医药等领域有巨大的应用前景。

1982年，美国食品卫生和医药管理局批准，用基因工程在细菌中生产人的胰岛素投放市场。

1985年，转基因植物获得成功。

1994年，延熟保鲜的转基因番茄商品生产。

1996年全世界转基因植物种植面积为170万公顷，1997年为1100万公顷，1998年为2780万公顷，1999年达到3990万公顷，2000年达到4420万公顷，2001年达到5260万公顷，2002年达到5000万公顷。32001年种植面积已超过100万公顷的作物有：大豆（3330万hm2，占全世界转基因作物的63%，均为抗除草剂大豆）、玉米（980万hm2，占19%）、棉花（680万hm2，占13%）、油菜（270万hm2，5%）；其它还有水稻、小麦、花生、向日葵、亚麻、甘蓝、马铃薯等，番茄、烟草、南瓜和木瓜等50多种转基因作物已实现商品化。

主要分布在美国（3570万hm2）、阿根廷（1180万hm2）、加拿大（320万hm2）和中国（150万hm2）等国。

我国（2001年）的转基因农作物和林木已达22种，其中转基因棉花、大豆、马铃薯、烟草、玉米、花生、菠菜、甜椒、小麦等进行了田间试验，转基因棉花已经大规模商品化生产。4当前情况：与1996年转基因作物开始商业化时相比，当前全球转基因作物总面积已增加了100倍以上，2013年已达1.75亿公顷，超过了中国农田的总面积。全球批准商业化生产的转基因作物有27种，其中最主要四种是大豆、玉米、棉花和油菜。美国超市中有70%的产品含有转基因成分。事实上全球食用过转基因食品的人群达几十亿。有几亿人大量食用已经超过十年。美国是世界上大规模种植转基因作物最早的国家，2013年已经种植了7010万公顷的转基因作物。巴西是种植转基因作物最多的发展中国家，2013年种植面积已超过4000万公顷，居世界第二。2013年中国种植了420万公顷的转基因作物，主要是棉花，和几千公顷抗病毒的木瓜，现在居世界第六。中国原来是世界第二，现在已经被其他国家赶超了。目前欧盟基于科学评价，认为“生物技术，特别是转基因技术，并不比传统育种技术危险。”全球有69个国家要求对转基因产品进行标识，中国是转基因产品标识最多的国家。5三、基因工程的概念

基因工程或遗传工程，是将分子遗传学的理论与技术相结合，用来改造、创建动、植物新品种，工业化生产生物产品，诊断和治疗人类遗传疾病的一个新领域。

基因工程：是一种DNA重组技术，在分子水平上进行遗传操作，按设计的蓝图，从供体中提取或人工合成目的基因，令其与载体构建成重组DNA，再转移到受体细胞，目的基因在细胞中表达获得新的遗传性状。

基因工程的基本操作程序为：获取目的基因、目的基因与载体构建重组DNA分子、重组DNA分子转移至受体细胞、转化细胞的扩增、鉴定和筛选。6第一节

核酸酶和限制性内切酶

核酸分解的第一步是水解核苷酸之间的磷酸二酯键，在微生物和高等动植物中都有作用于磷酸二酯键的核酸酶。不同来源的核酸酶，其专一性、作用方式都有所不同。有些核酸酶只能作用于RNA，称为核糖核酸酶（RNase），有些核酸酶只能作用于DNA，称为脱氧核糖核酸酶（DNase），有些核酸酶专一性较低，既能作用于RNA也能作用于DNA，因此统称为核酸酶（nuclease）。根据核酸酶作用的位置不同，又可将核酸酶分为核酸外切酶（exonuclease）和核酸内切酶（endonuclease）。7一、核酸外切酶有些核酸酶能从DNA或RNA链的一端逐个水解下单核苷酸，所以称为核酸外切酶。只作用于DNA的核酸外切酶称为脱氧核糖核酸外切酶，只作用于RNA的核酸外切酶称为核糖核酸外切酶；也有一些核酸外切酶可以作用于DNA或RNA。核酸外切酶从3′端开始逐个水解核苷酸，称为3′→5′外切酶，例如，蛇毒磷酸二酯酶即是一种3′→5′外切酶；核酸外切酶从5′端开始逐个水解核苷酸，称为5′→3′外切酶，例如：牛脾磷酸二酯酶即是一种5′→3′外切酶。二、核酸内切酶核酸内切酶催化水解多核苷酸内部的磷酸二酯键。有些核酸内切酶仅水解5′磷酸二酯键，把磷酸基团留在3′位置上，称为5′-内切酶；而有些仅水解3′-磷酸二酯键，把磷酸基团留在5′位置上，称为3′-内切酶。还有一些核酸内切酶对磷酸酯键一侧的碱基有专一要求，例如胰脏核糖核酸酶（RNaseA）即是一种高度专一性核酸内切酶，它作用于嘧啶核苷酸的C′3上的磷酸根和相邻核苷酸的C′5之间的键，产物为3′嘧啶单核苷酸或以3′嘧啶核苷酸结尾的低聚核苷酸。8三、限制性核酸内切酶

20世纪70年代，在细菌中陆续发现了一类核酸内切酶，能专一性地识别并水解双链DNA上的特异核苷酸顺序，称为限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease，简称限制酶）。当外源DNA侵入细菌后，限制性内切酶可将其水解切成片段，从而限制了外源DNA在细菌细胞内的表达，而细菌本身的DNA由于在该特异核苷酸顺序处被甲基化酶修饰，不被水解，从而得到保护（细菌细胞中存在限制修饰系统）。近年来，限制性核酸内切酶的研究和应用发展很快，目前已分离到200多种，提纯的限制性核酸内切酶有100多种，许多已成为基因工程研究中必不可少的工具酶。

1．限制性内切酶的命名：根据其来自的生物名称，用英文字母和数字表示；以宿主生物属名头一个字母和种名头两个字母斜体表示宿主，以非斜体字母表示菌株，以罗马字母表示同一菌株的不同限制酶系统。①EcoRI来自Escherichiacoli；②HindⅢ来自Haemophilusinfluenzae。92．限制性内切酶的类别：限制性核酸内切酶可被分成三种类型。Ⅰ型和Ⅲ型限制酶水解DNA需要消耗ATP，全酶中的部分亚基有通过在特殊碱基上补加甲基基团对DNA进行化学修饰的活性。Ⅱ型限制酶水解DNA不需要ATP也不以甲基化或其它方式修饰DNA，能在所识别的特殊核苷酸顺序内或附近切割DNA。因此，被广泛用于DNA分子克隆和序列测定.

第Ⅰ类酶:每隔一段DNA序列随机切割双链DNA分子，没有序列特异性,酶切位点不定。如EcoB(大肠杆菌B株)、EcoK(大肠杆菌K株)分子量较大(300000)，作用时需ATP、Mg2+等辅助因子。第Ⅱ类酶:能识别一段特异的DNA序列，准确地酶切双链DNA的特异序列，这些特定碱基组成的DNA序列叫内切酶的识别位点或限制性位点，长度一般在4至8个碱基对之间。如EcoRI(大肠杆菌)、HindⅢ(嗜血杆菌)，分子量较小(约20000-100000)，作用时需Mg2+存在。10根据第Ⅱ类酶的剪切特点又可分为两类：（1）识别的序列是对称的，即在一条链中从5’到3’方向的序列，与其互补链从5’到3’方向的序列完全相同。这种从两个方向阅读而序列相同的序列称为回纹对称序列(palindrome)，如：EcoRⅠ；（2）另一类酶，如SmaⅠ，它们酶切DNA双链后，产生的DNA片段具有平齐末端(bluntends)。限制性酶EcoRI识别位点（粘性末端）SmaⅠ识别位点（平齐末端）11123．限制性内切酶的主要用途（１）重组DNA分子

a.匹配末端的连接：同一种酶切割不同DNA分子产生相同的突出末端；或不同酶（同尾酶）切割不同DNA分子产生相同的突出末端，可在连接酶作用下连接为重组DNA分子；

b.平端连接：可直接连接，但效率较低；c.不匹配黏端的连接：先补平(Klenow)或修平(S1)后再连接（２）绘制物理图谱（限制性内切酶图谱）

通常DNA上存在大量的限制性内切酶酶切位点。因此，限制性内切酶能将很长的DNA分子酶解成许多长短不一的小片段，片段的数目和长度反映了DNA分子上限制性酶切位点的分布。特定的DNA／限制性内切酶组合所产生的片段是特异的，它能作为某一DNA（或含有该DNA的生物）的特有“指纹”，这种“指纹”在DNA分子水平上直接反映了生物的遗传多态性。

（3）限制性酶切片段长度多态性分析a.限制性片段长度多态性（RFLP，RestrictionFragmentLengthPolymorphism）。b.扩增片段长度多态性（AFLP，

AmplifiedFragmentLengthPolymorphism)。13RFLP检测变异的原理RFLP图谱AFLP的银染检测14四、其它工具酶1．DNA聚合酶（１）依赖DNA的——DNA聚合酶Ⅰ、DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow）、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、修饰的T7DNA聚合酶、TaqDNA聚合酶；（２）不依赖DNA的——末端转移酶(Terminaltransferase,TdT）是一种无需模板，催化核苷酸结合到DNA分子的3'羟基端)；（３）依赖RNA的——反转录酶。15

２．DNA连接酶

该酶的用途是将带匹配黏端的双链DNA或平端双链DNA片段的5’-P与另一也带相应缺口的DNA片段的3′-OH连接起来。

３．甲基化酶在E.coli中，大多数都有三个位点特异性的DNA甲基化酶。如：Dam甲基化酶可在GATC序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基。Dcm甲基化酶识别CCAGG或CCTGG序列，在第二个胞嘧啶C的C5位置上引入甲基。EcoKⅠ甲基化酶的识别位点少，识别AAC（N）6GTGC和GCAC（N）6GTT序列中A的N6位置。另外，SssⅠ甲基化酶来自原核生物Spiroplasma，可使CG序列中的C在C5位置上甲基化。16第二节

基因的克隆与重组一般而言，一个基因是编码一条多肽链的一个DNA片段，包括启动子、终止子及内含子等。在基因克隆和DNA重组技术出现之前，由于DNA分子量大而结构单一，DNA是细胞中最难分析的大分子。基因克隆和DNA重组技术出现之后，DNA已成为细胞中最易操作分析的大分子。利用这一技术，可从一个含有10万个基因的大基因组中，准确地分离出特异的单个目的基因。

DNA的体外重组是指通过酶的修剪和连接，使目的DNA分子与载体DNA共价连接获得重组DNA分子的过程。其中分离与鉴定目的基因是DNA重组中的关键步骤之一。17一、目的基因的获取（一）从基因库中分离基因1．基因文库的概念

基因文库是一组DNA和cDNA序列克隆的集合体。将某种生物全部基因组的遗传信息储存在可以长期保存的、稳定的重组体中，以便需要时即可应用。当需要某一目的基因时，就可在基因文库中寻找，一般采用核酸探针的方法，从文库中“钓出”某基因。2．基因文库的种类根据核酸序列的来源，基因库可分为：核基因库、染色体库、cDNA库、线粒体库等。18３．各种基因库的构建（１）核基因库

核基因库(genomiclibrary)：将某生物全部基因组DNA酶切后与载体连接构建而成的。理想的核基因库应能包括全部基因组序列。构建文库可采用不同的载体：

质粒载体：重组质粒导入感受态细胞，收集所有菌落。

噬菌体或(柯斯质粒)载体：重组DNA包装进噬菌体，感染细菌，收集噬菌斑。

BAC(细菌人工染色体)或YAC(酵母人工染色体)载体：重组人工染色体，导入相应宿主细胞，收集所有细胞，即为基因库。19（２）染色体基因库将基因组的一部分如一条染色体用来构建基因库；可用于选择特定基因以及分析染色体的组织和结构。在果蝇的多线染色体中，通过对染色体进行微切割，还可构建染色体区段基因文库。在人类基因组项目研究中，利用流动细胞分离(flowcytometry)技术将人类染色体分开，用于构建单个染色体基因库，大大加速了人类基因组作图和分析。利用改良的脉冲电泳方法（pulsedfieldgelelectro-phoresis，PFGE），可将酵母的16条染色体据其分子量大小分开后，用于构建染色体库，在基因组分析中发挥作用。20（３）cDNA库以mRNA为模板，经反转录酶合成互补DNA，构建的基因库称cDNA库。真核生物mRNA的3’端具有一段多聚A尾端序列

得到的双链DNA分子经两端补齐后

以带有限制性酶切点的人工接头连接

酶切后与载体（通常是噬菌体）连接

制备cDNA库。21（4）cDNA库与核DNA库的关系cDNA库仅具有细胞或组织内表达基因的mRNA序列

仅包括基因组的部分基因序列。cDNA库对于研究基因的表达模式、分离某一特定基因是十分有用的。通常是将cDNA库与核基因库配合使用，以便既能得到基因的编码序列，又可得到基因的调控序列。224．从基因库筛选目的基因（１）根据待选基因相关信息

确定筛选方法和条件

从基因库中筛选、分离基因。（２）多数方法是利用一段核苷酸序列(DNA、cDNA或寡聚核苷酸)或抗体作探针(Probe)，用放射性同位素或非放射性同位素标记探针

筛选基因库。（３）筛库过程：将转化或转染后菌落印影在滤膜上

用碱裂解、中和后洗涤烘干

再用目的基因的放射性DNA或mRNA作探针进行杂交放射性自显影

凡黑点菌落即为阳性克隆。23５．阳性克隆的分析与鉴定从基因库中筛选出的阳性克隆

分析、鉴定

得到目的基因。（１）限制性酶图谱法：构建阳性克隆的限制性酶图谱

根据同源性分析，可了解阳性克隆片段的酶切位点及相对位置

用于进一步亚克隆或同已知的其它序列比较。（２）分子杂交法：Southern杂交分析、Northern杂交分析、Western杂交分析。（３）核酸序列测定法：克隆后的DNA片段进行核酸序列测定后

确定该DNA片段序列的正确性。（４）核酸序列分析与预测：测定的核酸序列是否为基因、有什么功能，需用计算机软件或生物学实验进一步分析。如同源性比较和阅读框架分析等。24（二）利用PCR克隆目的基因

1．反向PCR（inversePCR，I-PCR）克隆基因组DNA片段：I-PCR是根据已知序列扩增其旁侧序列的方法。所用的引物与正常的PCR引物方向相反。

２．反转录PCR(reversetranscription-PCR，RT-PCR)合成cDNA：RT-PCR是以mRNA为模板，在逆转录酶作用下合成cDNA，再复制成双链DNA。（三）基因的人工合成

如果已知某基因的核苷酸序列，或者通过基因产物的氨基酸序列推导出基因的核苷酸序列，就可将单核苷酸或寡核苷酸一个一个缩合起来，成为一个基因的核苷酸序列。

先合成分别属于双链序列的8-12碱基的片段，两个片段的对应部分配对后留有粘性末端，第三个片段再连接上去，不断延伸直至全部合成。25二、载体（vector）

载体：是将“目的”基因导入受体细胞的运载工具。DNA片段与适合的载体DNA连接构成重组DNA

在载体DNA的运载下，高效率地进入宿主细胞，并在其中进行复制。

DNA载体：主要有质粒、噬菌体、病毒、细菌人工染色体或酵母人工染色体等。

载体的条件：①具有复制原点，能自我复制；②具多克隆位点(multiplecloningsite，MCS或Polylinkerregion)即有多种限制酶的切点；③选择时的遗传标记，如抗生素基因；④易从宿主细胞中回收。261．细菌质粒（１）质粒是细菌细胞内独立于细菌染色体而自然存在的、能自我复制、易分离和导入的环状双链DNA分子（２）质粒具有重组表型检测标记，检测是否携带外源DNA片段。（３）根据质粒在细胞内的复制程度可分为：严紧型质粒（一个细菌细胞内的质粒数量有1-2个）和松驰型质粒（每个细胞内有的20-60个）。（４）例如，pUC18质粒具有以下特点：分子量小，可接受较大外源片段；拷贝数多，每个细胞中有500个；克隆位点的酶切位点多，克隆方便；具有α-互补的显色表型，用于检测重组质粒的选择标记。27重组质粒转化宿主细胞后，利用α互补现象进行筛选是最常用的一种鉴定方法。现在使用的许多载体都具有LacZ′基因，它编码的α-肽链是β-半乳糖苷酶的氨基端的短片段（146个氨基酸）。宿主和质粒编码的片段各自都不具有酶活性，但它们可以通过片段互补的机制形成具有功能活性的β-半乳糖苷酶分子。LacZ′基因编码的α-肽链与失去了正常氨基端的β-半乳糖苷酶突变体互补，这种现象称为α-互补。β半乳糖苷酶将无色的化合物X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）割成半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4-靛蓝而显色。在IPTG（异丙基硫代β-D-半乳糖苷）诱导后，在含有X-gal的培养基平板上形成蓝色菌落。而当有外源DNA片段插入到位于lacZ′中的多克隆位点后，就会破坏α肽链的阅读框，从而不能合成与受体菌内突变的β半乳糖苷酶相互补的活性α肽，而导致不能形成有功能活性的β半乳糖苷酶，因此含有重组质粒载体的克隆往往是白色菌落。（５）α-互补和蓝白斑筛选的原理28蓝白