生物化学实验

生物化学实验东北林业大学毕冰实验目录实验1纸层析分离氨基酸

实验2血清（蛋清）蛋白的醋酸纤维薄膜电泳实验3酵母核糖核酸（RNA）的分离及组份鉴定实验4酶的特性

实验5小麦萌发前后淀粉酶活力的比较实验6核黄素的可见、紫外分光光度法测定实验7肌糖原的酵解作用实验8氨基移换反应的定性试验实验成绩考核办法（1）每个实验占12分，最高分96分。（2）每次实验按考勤、实际操作、实验报告三方面进行考核。实验成绩考核办法（3）考勤方面：3分要求上课不迟到，不早退，不无故旷课，如能遵守,则给满分：如无故不来，则12分全扣。如有特殊情况提前与实验老师联系，与其他班同上。实验成绩考核办法（4）实际操作方面：3分。要求遵守实验室的规章制度，不得在实验室内打闹喧哗，认真预习，准确操作，不得损坏实验室仪器物品，实验结果较好，清洁收尾工作较好（每次实验结束实验台、窗台、边台、讲台、黑板擦干净、仪器设备断开电源并清洗干净，摆放整齐，不用回收的药品倒掉，垃圾每次倾倒，地面全面彻底擦干净，凳子靠在实验台边上摆放整齐。老师检查合格后方可离开）。如违反以上规定则酌情减分。（5）实验报告方面：6分。要求能够及时上交实验报告（课代表负责收齐，下一次实验之前上交），准确按照要求书写实验报告，书写工整、清晰，并对实验给出准确的结果和正确的分析讨论。如违反以上规定则酌情减分。以上三方面的综合得分为每个实验的成绩，8个实验成绩相加即为实验最终成绩。实验成绩考核办法实验一纸层析分离氨基酸一、实验目的

通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。二实验原理

纸层析属于分配层析，是以滤纸为支持物，与滤纸纤维结合的水（约占纸重20～22%）为固定相，以有机溶剂醇酚等作为流动相。主要是根据被分析的样品在两种不相溶的溶剂系统中的分配系数（即二相中浓度比值）不同，它们随流动相在纸上移动的距离也不同，从而达到分离的目的。

各种氨基酸在滤纸上的迁移率用Rf（Rateflow）值表示：

色斑中心至点样原点中心的距离Rf＝溶剂前缘至点样原点中心的距离

纸层析法根据溶剂流动方向的不同，可分为垂直型和水平型:

垂直型：使流动相自下而上（上行法）或自上而下（下行法）扩展的为垂直型；水平型：将圆形滤纸置于水平位置，溶剂由中心向四周扩散的层析。本实验采用圆滤纸进行垂直型层析，将待测与标准氨基酸层析后，用茚三酮反应使之显色，观察对比色斑，计算Rf值。氨基酸的颜色反应

脯氨酸：茚三酮，呈黄色；

其他的α-氨基酸：茚三酮，紫红色，最终形成蓝紫色化合物。此反应十分灵敏，不仅适合大多数氨基酸，同样也适合于蛋白质，多肽的鉴定。1:1500000浓度的氨基酸水溶液也能发生此反应，由此也可作为氨基酸的定量测定。

三操作步骤

1.滤纸

取一张20cm×15cm层析滤纸，距纸边2cm处用铅笔划一横线，沿线每3cm画一圈为点样处，直径为0.5cm。2.点样

用微量加样器吸取标准品氨基酸和混合样，吸管与滤纸垂直，轻轻接触纸面，直径等于0.5cm。一滴滴完后用冷风吹干，再点第二次；共点三次。20cm15cm

将点完样的滤纸两侧面对齐，成筒状，用针线缝合。3.展层

取出层析缸内培养皿，加入展开液20ml。

正丁醇：甲酸：水=15：3：2

再加入茚三酮少许，放入层析缸内，将点样后的滤纸放入展层溶剂中，当溶剂展层至滤纸上沿1cm

处展层结束，用铅笔画出展层前沿位置，吹干，先用冷风吹干，再用热风吹显色，用铅笔描出各显色斑点形状。

五种标准氨基酸分别为:Ala，Leu，Pro，Lys，Asp

点样圈中心至显色斑点的距离

Rf=

点样圈中心至展层前沿的距离

4．Rf值的测定四注意事项

1铅笔格尺自备。

2点样圈不能距离纸边太近，各点之间的距离不能太近。

3吹干时一定要保证完全吹干。

4缝合时，滤纸的两个纸边不能相互接触并且底边应对齐。四注意事项

5使用移液管时应右手拿管，左手拿吸耳球并用食指堵管口。

6使用移液管时，应先看清管的最大刻度，每一格代表多少后再量取。

7展开剂取完后别忘加显色剂茚三酮。

8

点样划线时要轻，否则样品容易残留在线上。计算5种标准氨基酸的Rf值；将自己的实验结果贴在实验报告上。五结果分析与讨论

蛋清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳实验二

一实验目的学习醋酸纤维薄膜电泳的操作，了解电泳的一般原理。电泳:

带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象。带电颗粒在电场中的移动方向和迁移速度取决于：带电颗粒本身性质(所带电荷的性质，以及所带电荷数量、颗粒大小和形状)、电场强度、溶液的pH值、离子强度及电渗等因素。二实验原理

电泳是利用不同带电质点在同一电场中泳动速度不同分离物质的方法。不同的带电颗粒在同一电场中泳动速度不同，常用迁移率来表示。迁移率：带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法。

蛋白质具有两性性质：

α-氨基；

α-羧基；侧链基团（在一定的pH条件下能解离）。

当pH>pI时，蛋白质带负电，电泳时向正极移动；当pH<pI时，蛋白质带正电，电泳时向负极移动；当pH=pI时，蛋白质不带电，电泳时零移动。蛋白质的分离原理：

各种蛋白质的等电点、分子量及颗粒大小各不相同，在某一指定的pH值溶液中，各种蛋白质所带的电荷不同，因而在电场中迁移的方向和速度不同。电泳技术的应用：

电泳技术在生物化学与分子生物学研究中被广泛用于生物大分子或小分子（如蛋白质、核酸、氨基酸等）的分离纯化与分析鉴定等。以醋酸纤维素薄膜为支持物的一种区带电泳。这种薄膜具有均一的泡沫状结构，厚度为120μm，渗透性强，对样品无吸附作用，用它作支持物进行电泳，电泳效果比纸电泳好。优点：样品用量少，分离速度快，电泳图谱更为清晰，灵敏度也较高（5μg/ml以上）。目前已广泛应用于血清蛋白、血红蛋白、脂蛋白、同工酶的分离和测定等方面。醋酸纤维素薄膜电泳三操作步骤（一）浸泡用镊子夹取醋酸纤维薄膜放入缓冲液中浸泡20min。

若漂浮于液面的薄膜在15—30s内迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则此膜均匀可用于电泳；若薄膜润湿缓慢，色泽深浅不一或有条纹及斑点等，则表示薄膜不均匀应弃去，以免影响电泳结果。（二）点样把膜条从缓冲液中取出，夹在两层粗滤纸内吸干多余的水分，然后平铺于玻璃板上（无光泽面朝上）。将点样器先放在蛋清中蘸一下，再在膜条一端2-3cm处轻轻垂直水平落下并立即提起，这样即在膜条上点了细条状的蛋清样品。＋

此步是实验的关键，点样前应在滤纸上反复练习，掌握点样技术后再正式点样。

（三）电泳将膜条平悬于电泳槽支架的滤纸桥上，膜条上点样一端靠近负极。盖严电泳室，通电，调节电压160伏，电流强度0.4—0.7mA/cm膜条，时间为60min

。

（四）染色电泳完毕后将膜条取出，放在染液中浸泡10min。染色液为氨基黑10B。

(五）漂洗将膜条从染色液中取出后先用自来水冲洗至无染液滴下,移至漂洗液中漂洗数次，至无蛋白区底色脱净为止。可见到色带清晰的电泳图谱。漂洗液为乙醇:冰醋酸:水=45:5:50

(六）透明放入透明液时，应左手拿玻璃板，右手用镊子夹好膜放入透明液中数秒钟立即提起并迅速铺于玻璃板上。(用吹风机完全吹干后将膜条小心揭下。)

四实验结果

将自己的实验结果贴在实验报告上；写明分离得到几种蛋白组分。五注意事项1.在粗滤纸内吸干时不要用力压，轻轻吸干即可。

2.点样时，样品量不要太多，越细越直为好。

3.两层湿滤纸桥之间不能有气泡。

4.染液用后回收，培养皿清洗干净。

5.膜条的点样端应在负极，通常黑色为负极。

6.漂洗分四次，每人都先从第一个培养皿开始依次到第四个培养皿。

7.放入透明液时，应左手拿玻璃板，右手用镊子夹好膜放入透明液中数秒钟立即提起并迅速铺于玻璃板上。用吹风机完全吹干后取出。

蛋清化学组成及性质蛋清层主要组分是水，混合蛋清含水87%～89%。蛋清是一种蛋白质体系，蛋清中的蛋白质包括:(1)卵清蛋白;(2)伴清蛋白;(3)卵类粘蛋白;(4)溶菌酶;(5)卵粘蛋白。

酵母核糖核酸的分离及组份鉴定实验三

一实验目的了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。二实验原理

酵母中的核糖核酸可溶于碱，在碱提取液中加酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此得到粗核糖核酸。核酸含有核糖，嘌呤碱，嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。三操作步骤（一）分离

将5g酵母悬浮于30ml

0.04mol/L氢氧化钠溶液中，在研钵中研磨均匀移至100ml锥形瓶内，在沸水浴中加热30min后冷却，配平后离心(3,000转/min)15min。将上清液缓慢倾入到搅拌的酸性乙醇溶液（10ml）中，待核糖核酸完全沉淀后离心(3000转/min)3min，弃上清。用95%乙醇洗沉淀一次，转移至布氏漏斗中抽滤。（二）组分鉴定

取核糖核酸加入1.5mol/L硫酸10ml，沸水浴中加热10min制成水解液进行组分鉴定。

1.嘌呤碱取一只试管，加入过量的浓氨水（用吸管吸约超过1ml），并加入1ml0.1mol/L硝酸银，再加入1ml水解液，观察有无嘌呤碱的银化合物沉淀生成。2.核糖取一只试管，加入水解液1ml，三氯化铁浓盐酸溶液2ml，加入苔黑酚乙醇溶液0.2ml，放入沸水浴中1-2min。注意溶液是否变绿，说明核糖的存在。

3.磷酸取一只试管，加入水解液1ml和定磷试剂1ml，在沸水浴中加热5min。观察溶液是否变成蓝色，说明磷酸是否存在。四实验结果请写出实验结果并分析。

五注意事项

1NaOH先少量多次加入，研磨均匀后再加入剩余量。

2离心时，首先一定用天平配平。

3嘌呤碱的检测时加入药品的顺序不能颠倒，一定沿管壁加入，试管不要振荡。

4为了提高效率，离心时要四只离心管一起离心。思考题1、如何得到高产量RNA的粗制品？2、本实验RNA组分是什么？怎样验证的？

酶的特性实验四实验目的

通过观察酶作用底物的特异性以及温度、激活剂、抑制剂和pH值对酶的活性的影响,加深对酶的性质的认识。1

原理

酶具有高度的专一性。淀粉酶水解淀粉生成有还原性的麦芽糖，但不能催化蔗糖的水解。淀粉和蔗糖无还原性，用Benedict试剂检查糖的还原性。

2步骤取四只试管，按下表添加。一酶的专一性112α-D-葡萄糖-（1→2）-β-D-果糖

试管号12Benedict2ml2ml1%淀粉4d/2%蔗糖/4d

混匀，沸水浴中煮2—3min。

试管号34

淀粉酶1ml1ml1%淀粉3ml/2%蔗糖/3ml

混匀，37℃保温15min.Benedict2ml2ml

混匀，沸水浴中煮2—3min。观察有无黄色沉淀产生。1、2、二温度对酶活力的影响

1

原理

酶的催化作用受温度的影响，在最适温度下，酶的反应速度最高。大多数动物酶的最适温度37—40℃，植物酶的最适温度为50—60℃

。

酶对温度的稳定性与其存在形式有关。有些酶的干燥制剂，虽加热到100℃

，其活性并无明显变化，但在100℃的溶液中却容易失活。低温能降低或抑制酶的活性，但不能使酶失活。

试管号5670.2%淀粉2ml2ml2ml

37℃

5min冰浴5min1ml\\

淀粉酶\1ml1ml

各试管混匀

37℃20min冰浴20min

碘--碘化钾溶液2d2d2d

比较各试管的颜色，判断淀粉被淀粉酶水解的程度。并说明温度对淀粉酶活性的影响。

37℃5min煮沸5-15min的淀粉酶37℃20min三激活剂和抑制剂对酶活性的影响1

原理酶的活性受激活剂或抑制剂的影响。能使酶的活性增加的物质，称为激活剂，能使酶的活性降低的物质，称为抑制剂。

氯离子为淀粉酶的活化剂，铜离子为其抑制剂。

2

步骤取三只试管，按下表加入试剂。

试管号89100.1%硫酸铜\1ml\1%氯化钠1ml\\

蒸馏水\\1ml0.1%淀粉3ml3ml3ml

淀粉酶1ml1ml1ml

混匀37℃保温10—15min冷却。

碘—碘化钾溶液

2—3d

2—3d

2—3d

观察比较三只试管颜色深浅，并解释。四pH对酶活性的影响1

原理

酶的活力受环境pH的影响极为显著，不同酶的最适pH值不同。本实验观察pH对淀粉酶活性的影响，淀粉酶的最适pH约为6.8。

2

操作

取4只锥型瓶，按下表添加缓冲液。每实验台各配30毫升。（可用滴管调pH值）

锥型瓶号0.2mol/L磷酸氢二钠0.1mol/L柠檬酸pH115.45ml14.55ml5.0218.15ml11.85ml5.8323.16ml6.84ml6.8429.16ml0.84ml8.0取4只试管，按下表添加。

试管号5678

缓冲液1瓶3ml2瓶3ml3瓶3ml4瓶3ml0.5%淀粉2ml2ml2ml2ml

淀粉酶2ml2ml2ml2ml

向各试管中加入淀粉酶的时间间隔各为1min。将各试管内容物混匀，并依次置于37℃恒温水浴中保温。第8管加入淀粉酶2min后，每隔1min由第7管取出一滴混合液，置于白瓷板上，加1小滴碘化钾—碘溶液，检验淀粉的水解程度。待混合液变为棕黄色时，向所有试管依次添加1—2滴碘化钾—碘溶液。添加碘化钾—碘溶液的时间间隔，从第5管起，亦均为1min。3结果观察各试管内容物呈现的颜色，分析对淀粉酶活性的影响。五注意事项各实验所用的淀粉浓度不同，应注意不要加错。注意保证对照组反应时间和其他基本条件的一致。每次加试剂后都要摇匀，碘液不要滴在管壁上。各管均应置于相应温度下或取出后立即加碘液摇匀。加淀粉酶和加碘液时的时间间隔要保持一致，即在反应时间一样的条件下，观察反应的速度。试管要冲洗干净，否则影响实验结果。淀粉水解程度不同，遇碘呈色反应不同。因此，可以通过呈色反应，了解淀粉水解的程度，从而间接判断唾液淀粉酶活力的大小。淀粉水解如下：

遇碘呈蓝色紫色红色碘本色（黄）碘本色（黄）中间可能出现其它过渡色，如蓝紫色、棕红色等。淀粉紫色糊精红色糊精无色糊精麦芽糖思考题1.激动剂和抑制剂有哪几种类型？其作用原理是什么？2．温度和pH影响酶活性的原理是什么？3．联系实验结果及所学理论，说明pH对酶活性的影响有什么规律和实际意义？4.酶作为生物催化剂具有哪些特征？5.进行酶学实验必须注意控制哪些条件？为什么？实验五小麦萌发前后淀粉酶活力的比较

1学习分光光度计的原理和使用方法。2学习测定淀粉酶活力的方法。3了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化。一实验目的二实验原理

淀粉酶是水解淀粉糖苷键的一类酶的总称。按照其水解淀粉的作用方式，可以分成α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化淀粉酶、异淀粉酶等。实验证明，在小麦、大麦、黑麦的休眠种子中只含有β-淀粉酶，α-淀粉酶是在发芽过程中形成的，所以在禾谷类萌发的种子和幼苗中，这两类淀粉酶都存在。其活性随萌发时间的延长而增高。二实验原理

本实验以淀粉酶催化淀粉生成麦芽糖的速度来测定酶的活力。麦芽糖是还原性糖，能使3，5-二硝基水杨酸还原成棕色的3-氨基5-硝基水杨酸，后者在500nm处有最大光吸收，可用分光光度法定量测定。三操作步骤1、标准曲线制作取干净刻度试管7支，编号，按下表加入试剂。

摇匀后，置沸水浴中煮沸5min。取出后迅速冷至室温，测定各管的A500，以麦芽糖含量为横坐标，A500值为纵坐标，绘制标准曲线。三操作步骤（2）、酶液的提取

幼苗酶的提取：取萌发的幼苗15株，放入研钵内，加石英砂0.2g，加1％NaCl溶液10ml，用力研磨成匀浆，在0～4℃下放置20min。将提取液移入离心管中，2000rpm离心10min。将上清液倒入量筒中，测定酶提取液的总体积。取酶液1ml用pH6.9的0.02mol/L磷酸缓冲液稀释至10ml，进行酶活力测定。

种子酶的提取：取浸泡2.5h种子15粒作对照，操作方法同上。

2、酶液的制备

（1）、小麦种子萌发：小麦种子浸泡24h后，放入25℃恒温箱内或在室温下发芽。三操作步骤3、酶活力测定（1）、取10ml刻度试管3支，编号，按下表加入试剂。

各管混匀后在45℃恒温水浴中水解3min，立即向各管中加入1％3，5-二硝基水杨酸溶液0.8ml。混匀后，放入80℃水浴中加热3min，迅速冷至室温，加水稀释至10ml，将各管充分混匀。用空白管作为对照，测定各管的A500值。四计算酶活力单位

1在标准曲线上查出各管相应的麦芽糖含量。2设在45℃、pH6.9的条件下，3min内水解淀粉释放1mg麦芽糖所需的酶量为1个活力单位（U），则15粒种子或15株幼苗的总酶活力单位=C酶×n×V酶式中C酶为种子酶或幼苗酶分解淀粉产生的麦芽糖的浓度(mg/ml)n为酶液稀释的倍数V酶为提取酶液的总体积（ml）

核黄素的可见、紫外分光光度法测定

实验六

一实验目的了解可见、紫外分光光度计的基本原理和使用方法。二实验原理利用物质所特有的吸收光谱来测定其含量，通过核黄素在可见和紫外分光光度计上都可以检测来比较可见分光光度计和紫外分光光度计的灵敏度差异。

核黄素含共轭结构异咯嗪核糖醇

三操作方法

1可见分光光度计的测定

（1）最大光吸收波长的确定将4ml标准核黄素溶液加入比色皿中，调节波长旋钮，找出最大光吸收值所对应的波长。

（2）标准曲线的制作分别准确量取一定量的标准核黄素溶液于6支试管中，并用蒸馏水补足至每管5ml。6支试管中核黄素的含量呈梯度上升，其中第6支试管的光吸收值为0.6左右(以蒸馏水为对照)。

（3）核黄素最低检出量的确定

取4mg/100ml核黄素4ml加入比色皿中，以蒸馏水为标准管，用722分光光度计测其吸光度，用注射器取出2ml核黄素再加入2ml蒸馏水并混合均匀在测其吸光度值,依次成倍稀释并测其吸光度值，直至其吸光度值不变为止（检测值偏离线性关系），确定最低检出量。（保留样品）

2紫外分光光度计的测定（1）最大光吸收波长的确定操作方法同可见光分光光度计的方法。用752分光光度计测其紫外最大光吸收波长。提示:比色皿应改用石英比色皿。

（2）标准曲线的制作用752分光光度计检测，操作方法参考可见光分光光度计的方法。（3）核黄素最低检出量的确定

将可见光分光光度计无法检出的样品倒入石英比色皿中继续稀释检测（用752检测），直至检测不出为止（检测值偏离线性关系），确定最低检出量。

3比较紫外和可见的灵敏度并计算相差的倍数。

四、注意事项

1、在操作过程中取样量要准确量取。

2、要认真阅读仪器使用说明书，按照说明书的操作规程进行操作。

3、在操作过程中要防止比色皿的打碎和破损，石英比色皿和玻璃比色皿不要弄混。

4、仪器连续使用时间不能过长，防止光电管疲劳。

5、测定时要用待测样冲洗杯几次。

四计算酶活力单位

1在标准曲线上查出各管相应的麦芽糖含量。2设在45℃、pH6.9的条件下，3min内水解淀粉释放1mg麦芽糖所需的酶量为1个活力单位（U）,则15粒种子或15株幼苗的总酶活力单位=C酶×n×V酶式中C酶为种子酶或幼苗酶分解淀粉产生的麦芽糖的浓度(mg/ml)n为酶液稀释的倍数V酶为提取酶液的总体积（ml）

实验七

肌糖原的酵解作用

一实验目的学习鉴定糖酵解作用的原理和方法，了解糖酵解作用在糖代谢过程中的地位及生理意义。

二实验原理肌糖原的酵解作用，即肌糖原在缺氧的条件下，经过一系列的酶促反应，最后转变成乳酸的过程。它是糖类供给组织能量的一种方式。本实验用乳酸的生成来检查糖原或淀粉的酵解作用。糖类和蛋白质干扰乳酸的测定。在除去蛋白质与糖后，乳酸可与硫酸共热产生甲醛，后者再与对羟基联苯反应产生紫红色物质。

三实验步骤

12pH7.4磷酸缓冲液3ml3ml0.5%淀粉溶液1ml1ml15%偏磷酸2ml/肌肉糜0.5g0.5g

用滴管加一滴管液体石蜡，37℃保温1.5h。15%偏磷酸/2ml

各试管过滤，弃沉淀。饱和硫酸铜1ml1ml氢氧化钙

液体体积的1/3液体体积的1/3

塞上橡皮塞，用力震荡（可用漩涡混和器），放置30min并不时震荡，过滤到3、4号管，弃沉淀。

56浓硫酸1.5ml1.5ml1.5%对羟基联苯2—3滴

2—3滴

置于冰浴中冷却。样品滤液

3管

0.25ml

4管

0.25ml

随加随摇动冰浴中的试管，注意冷却。混匀后放入沸水浴中显色后取出。

四实验结果比较颜色的深浅，并加以解释。五注意事项1加入药品的次序不能颠倒。

2加入肌肉糜后应充分混匀。

3过滤用的滤纸不要太厚，以免滤液量太少。

4加入氢氧化钙的量不要太多，一般以半药勺为宜。是以液体的量多少酌情加减。实验八

氨基移换反应的定性实验

一实验目的学习应用纸层析法鉴定氨基移换反应。二实验原理本实验观察肌肉糜谷丙转氨酶所催化的氨基移换反应。在反应后借纸层析法检查底物谷氨酸的减少和产物丙氨酸的生成。为防止丙氨酸被肌肉糜中其它的酶所氧化或还原，在反应系统中加入了抑制剂碘乙酸。

三实验步骤

（一）

酶液的制备

取肌肉糜2g放入研钵中，加入3毫升磷酸缓冲液，研成匀浆，备用。每实验台做两份。

（二）

体外氨基移换反应

15%三氯乙酸

酶液0．5%谷氨酸1%丙酮酸钠0．1%碳酸氢钾0．05%碘乙酸1210d/10d10d10d10d10d10d10d10d10d10d

混匀，放入40º恒温水浴保温1h.15%三氯乙酸/10d

每实验台做两份。取2支试管，编号。(三）纸上层析法检查

取一张滤纸，用铅笔划成4等份。4个角上标明1、2、3、4。距滤纸中心划一半径1.5cm的圆圈为点样基线。取4根毛细管，分别将1号管、2号管、标准谷氨酸溶液和标准丙氨酸溶液点在滤纸的1、2、3、4各分内层析基线部分的中点位置上。使每种溶液分别形成直径2—3mm的圆斑。每次点样后，用吹风机吹干再点下一次，共点三次。

在干净的培养皿中加入正丁醇：甲酸：水=7.5ml：1.5ml：1ml，加茚三酮少许。在点样后的滤纸中心插入一个用纸卷成的“灯心”并使“灯心”下端浸入展开剂中。展开40min（酌情）取出，用吹风机吹干。1234四实验结果

分析比较层析图谱，确定各点的氨基酸组成，并解释实验结果。1234五注意事项

1(一）、（二）每实验台做二份，（三）每人做一份。

2研磨后如果匀浆太稠可少量加入磷酸缓冲液。

3加入液体量的顺序不能颠倒。

4将滤纸分4等分时，要保证样品层析轨迹与滤纸纹路都成45度角。

5做实验时，要把手洗干净，将圆滤纸放在一洁净的普通纸上进行，尽量少用手接触滤纸，以免汗迹污染，影响显色结果的分析。6铅笔格尺自备，点样圈不能距离纸边太近，各点之间的距离不能太近。

7吹干时一定要保证完全吹干。

8展开剂取完后别忘加显色剂茚三酮。注意不要将茚三酮沾到手上。

9在层析操作时，圆滤纸千万不能折迭，一律用铅笔作标记（勿用圆珠笔）。

10滤纸芯卷得不要太紧，且要呈圆筒状，否则，展层不呈圆形，影响Rf值的计算。

五注意事项

思考题1.名词解释：

联合脱氨基作用；转氨基作用；氧化脱氨基作用；生糖氨基酸；生酮氨基酸2.图示或张贴层析图，鉴定丙氨酸和α-酮戊二酸是否进行了转氨基作用，并写出相关的反应式。3.实验操作过程中，为何不能用手接触滤纸？实验九蛋白质及氨基酸的呈色反应

实验目的

1、了解构成蛋白质的基本结构单位及主要联接方式。

2、了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。

3、学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。

一蛋白质及氨基酸的呈色反应（一）双缩脲反应实验原理

尿素加热至180℃左右，生成双缩脲并释放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中能与Cu离子结合生成紫红色的化合物，此反应成为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。操作方法

取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷却后，加10%NaOH1ml，振荡混匀，再加1%CuSO4溶液一滴，再振荡。观察出现的粉红颜色。避免加过量CuSO4，否则生成的蓝色氢氧化铜掩盖粉红色。取另一支试管加2%鸡蛋清溶液1ml和10%NaOH溶液2ml，摇匀，再加1%

CuSO42滴，随加随摇试管，观察紫玫瑰色的出现。

（二）黄色反应

实验原理

含有苯环结构的氨基酸，遇硝酸后可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成深橙色的硝醌酸钠。

多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以才有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应。操作方法

取7支试管，按下表加入试剂管号材料（滴）浓硝酸（滴）现象12%鸡蛋清溶液422大豆提取液443指甲少许404头发少许4050.5%苯酚4460.3%色氨酸4470.3%酪氨酸44

（三）坂口反应

实验原理

精氨酸和许多胍代化合物与a-萘酚在碱性次溴酸钠溶液中发生反应，产生红色物质。操作方法

向各试管中按下表加入试剂，记录出现的现象。操作方法

本实验十分灵敏。a-萘酚要过量。次溴酸钠、精氨酸即蛋白质均不可过多，过多的次溴酸钠可继续氧化有色产物使颜色消失。

管号试剂（滴）123蒸馏水/450.3%精氨酸/1/2%鸡蛋清溶液5//20%NaOH555a-萘酚333NaBrO111现象（四）乙醛酸反应实验原理

在浓硫酸存在下，色氨酸与乙醛酸反应生成紫色物质，反映机理尚不清楚，可能是一分子乙醛酸与两分子色氨酸脱水缩合形成与靛蓝相似的物质。

操作方法

取三支试管，按下表加入试剂。操作方法

加入浓硫酸后静止，观察各管液面间紫色环的出现。若不明显，可在水浴中微热。

管号试剂123蒸馏水(滴)/250.3%色氨酸溶液（滴）/3/2%鸡蛋清溶液（滴）5//冰醋酸（ml）222混匀后，试管稍倾斜，沿管壁缓慢加入。浓硫酸（ml）111现象

（五）偶氮反应

偶氮化合物与酚核或咪唑环结合产生有色物质。它与酪氨酸和组氨酸反应的产物分别为红色和樱桃红色。

实验原理操作方法

取3支试管，按下表加入试剂并观察有色产物的生成。

管号试剂（滴）1230.3%组氨酸溶液4//0.3%酪氨酸溶液/4/鸡蛋清原液//4重氮试剂88820%NaOH溶液222现象

二糖的颜色反应(补充材料）(一)莫氏试验

(1)实验原理

糖经浓无机酸（硫酸、盐酸）脱水产生糠醛或糠醛衍生物，它们在浓无机酸作用下，能与α-萘酚生成紫红色缩合物。(2)操作步骤12341%葡萄糖1ml1%蔗糖溶液1ml1%淀粉溶液1ml滤纸少许加1ml水1ml莫氏试剂2d2d2d2d浓硫酸1.5ml1.5ml1.5ml1.5ml

浓硫酸沿管壁加，且勿振摇。观察液面交界处有无紫红色环出现。

(二)塞氏试验(1)

实验原理

酮糖在浓酸的作用下，脱水生成4-羟甲基糠醛，后者与间苯二酚作用成红色反应；有时亦同时产生棕色沉淀，此沉淀溶于乙醇，呈鲜红色溶液。(2)操作步骤1231%葡萄糖1ml1%蔗糖溶液1ml1%果糖溶液1ml塞氏试剂2.5ml

2.5ml

2.5ml

混匀后同时置于沸水浴中。比较各管颜色变化及红色出现先后顺序。三甘油三酯的颜色反应(1)

实验原理甘油三酯经正庚烷-异丙醇混合溶剂抽提后，用KOH溶液皂化，并进一步用过碘酸钠试剂氧化甘油生成甲醛，甲醛与乙酰丙酮试剂反应形二氢二甲基吡啶黄色衍生物。可用于比色测定。(2)操作步骤

取一支试管，加入甘油三酯溶液1ml、抽提液1ml和0.04mol/LH2SO40.3ml，边加边摇，加毕剧烈震动15秒钟，然后静止分层，吸取上层液与另一支试管中加入异丙醇1ml及皂化试剂0.2ml，混匀65˚C保温5分钟。再加入氧化试剂1ml及乙酰丙酮1ml，混匀后65˚C保温15分钟。观察颜色变化。（四）维生素的颜色反应(一)

维生素A的颜色反应

(1)

实验原理

维生素A与SbCl3作用生成蓝色。此蓝色反应虽非维生素A的特异反应（如胡萝卜素亦有类似反应，不过成色程度很弱），但一般可用来作维生素A的定性鉴定。(2)

实验操作

取干燥试管一支，加入1-2滴鱼肝油及10滴氯仿，混匀后加入醋酸酐2滴及三氯化锑-氯仿溶液2ml观察颜色变化并记录之。(二