血管内皮生长因子c对淋巴管新生的影响

血管内皮生长因子c对淋巴管新生的影响

炎症、外伤或肿瘤可导致淋巴管再生。已有的研究发现,碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)和血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)引起血管新生和淋巴管新生,VEGF-C是淋巴管内皮细胞的特异性生长因子,其受体是血管内皮生长因子受体-3(vascularendothelialgrowthfactorreceptor-3,VEGFR-3)(Flt-4)。尽管有人在体内实验研究了VEGF-C对于淋巴管新生的作用,但有关VEGF-C促进淋巴管新生的机制尚不清楚。淋巴管新生的基本过程包括内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成,其中内皮细胞的增殖和迁移是淋巴管新生的关键步骤。为此,本实验通过体外培养的淋巴管内皮细胞研究了VEGF-C对于淋巴管内皮细胞增殖和迁移的作用,并探讨了VEGF-C促进淋巴管新生的机制。材料和方法1.细胞内皮细胞的检测取成年狗的胸导管,放入预冷的HBSS(lifetechnologies,NY)中。剥去胸导管周围的结缔组织,用HBSS冲洗,除去管腔内的淋巴液。结扎上端,经下端注入Ⅰ型胶原蛋白酶溶液(25×104U/L),在37℃条件下消化10min。收集消化液,并用EMEM培养液(LifeTechnologies,NY)冲洗,将细胞悬液离心(1000r/min,10min)。用添加20%FBS(lifetechnologies,NY)、2mol/L谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸钠、3.5g/L葡萄糖、2mmol/LHEPES、10×104?IU/L青霉素和100mg/L链霉素的EMEM培养液混悬沉淀细胞,将细胞加入培养皿中,在37℃、5%CO2条件下进行培养。当细胞生长形成单层时,用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA的混合消化液消化后,传代培养。淋巴管内皮细胞的鉴定方法同文献,即用乙酰化低密度脂蛋白(biomedicaltechnologies,MA)吞噬实验、抗第Ⅷ凝血因子相关抗原抗体(nordicimmunologicallaboratory,thenetherlands)标记、UEAⅠ植物凝集素(Sigma,St.Louis)和硝酸银染色进行鉴定。全部实验均采用第3～5代细胞。2.vegfr-3检测兔抗兔的表达将淋巴管内皮细胞接种于盖玻片上,培养至形成单层。3%多聚甲醛固定后,用10%山羊血清封闭内源性抗原。加入兔抗人VEGFR-3抗体(1∶100,SantaCruzbiotechnology),在37℃条件下孵育2h。用PBS清洗后,加入FITC标记的羊抗兔IgG,在37℃条件下反应1h。用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜观察VEGFR-3的表达。以狗的股静脉内皮细胞染色和用PBS代替一抗作为阴性对照。3.细胞消化液的制备将细胞接种于35mm培养皿,细胞密度为3×105个/皿。当细胞生长接近形成单层时,用PBS浸洗细胞,再用不含FBS的培养液培养24h。实验分4组,即对照组以及分别在培养液中加入10μg/LbFGF、10μg/LVEGF和10μg/LVEGF-C(Sigma,St.Louis)组,每组2个培养皿,共4次实验。在37℃条件下,用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA的混合消化液消化细胞1min。取细胞悬液,用血细胞计数板分两次计数每个皿的细胞。4.细胞增殖实验按Tan的方法测定淋巴管内皮细胞的迁移。当细胞生长形成单层时,用宽为5mm的剃须刀片刮除细胞,每个培养皿刮除4处,每处25mm2。然后,用PBS洗去被刮除的细胞,再用不含FBS的培养液(添加细胞生长因子和0.1%明胶)培养24h。实验分组同细胞增殖实验,共3次实验。甲醇固定后,用10%Giemsa溶液染色。在装有方格目镜的显微镜下,按每格100μm计数近刮除标志线的单层细胞区细胞(5个格)和迁移至刮除区的细胞(1～6个格),并用目镜测微尺测量迁移细胞至刮除标志线的最大距离。计数和测量范围的宽度为300μm。在另一实验,用硝酸银染色法观察刮除标志线两侧细胞的细胞间连接变化。5.tri能力标记f-肌动蛋白淋巴管内皮细胞的F-肌动蛋白标记方法同文献。在刮除细胞实验的培养皿,用3%多聚甲醛固定细胞20min。洗去固定液后,在-20℃条件下用0.5%TritonX-100处理细胞10min,再用BODIPYFLphallacidin(molecularprobes,Oregon)标记F-肌动蛋白。在荧光显微镜和LSM510共聚焦激光扫描显微镜(ZeissAxiovert,Germany)下,观察迁移细胞的F-肌动蛋白重组和应力纤维形成的变化。结果1.vegfr-3在细胞上的表达在荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜下观察到,VEGFR-3在淋巴管内皮细胞膜上均匀表达,但静脉内皮细胞的VEGFR-3表达呈阴性(图1)。2.bfgf-vegf对k-ras基因突变的crc细胞增殖的影响对照组、bFGF组、VEGF组和VEGF-C组的淋巴管内皮细胞增长倍数分别为1.17、1.24、2.24和2.74。与对照组比较,bFGF组和VEGF-C组促进细胞增殖,但VEGF的作用不明显。VEGF-C组和bFGF组的促进细胞增殖作用差异显著(表1)。3.移植细胞间连接的特征线刮除细胞后,未刮除侧的细胞向刮除侧迁移。在硝酸银染色的对照组培养皿,未刮除侧近刮除标志线的1～2排细胞的细胞间连接处没有着色。在生长因子组,未刮除侧近刮除标志线的没有着色的细胞可达4排。迁移至刮除侧细胞的细胞间连接不明显(图2)。与对照组相比,bFGF组、VEGF组和VEGF-C组的迁移至刮除区的细胞数增多,最大迁移距离增大。VEGF-C组与bFGF组及VEGF组的迁移细胞数和最大迁移距离差异显著(图3,表2)。4.应力纤维-f-肌动蛋白的迁移与迁移在未迁移的细胞内,F-肌动蛋白微丝束较细,位于淋巴管内皮细胞周边。附着斑较多,此处的F-肌动蛋白丰富。迁移的细胞出现头部和尾部,头部有波褶、板状伪足和丝状伪足。附着斑减少,位于细胞底部并与细胞长轴平行的应力纤维增多。与对照组比较,生长因子组促进F-肌动蛋白的重组和应力纤维的形成,特别是VEGF-C组(图4)。vegf-c的调节作用淋巴管新生除依赖于内皮细胞的生物学特性外,还取决于局部微环境的趋化因子、生长因子和细胞外基质的作用。在生理状态下,淋巴管内皮细胞呈静止状态,无增殖和迁移活性。本实验培养的淋巴管内皮细胞自接种至形成单层的倍增时间约为24h。为了避免FBS中的生长因子对淋巴管内皮细胞增殖和迁移的影响,实验中用不含FBS的培养液培养细胞。bFGF诱导淋巴管内皮细胞在Ⅰ型胶原蛋白凝胶和Matrigel基膜基质凝胶内形成毛细淋巴管样结构,非抗凝血性肝素加强bFGF对于淋巴管新生的作用?。VEGF通过上调内皮细胞的纤维蛋白溶酶原激活物的活性引起淋巴管形成。VEGF-C是VEGF家族的新成员,与淋巴管内皮细胞的受体特异性结合。通过转基因技术研究发现,VEGF-C诱导正常皮肤和肿瘤的淋巴管新生。本实验观察到,bFGF和VEGF-C促进淋巴管内皮细胞的增殖和迁移,但VEGF只促进淋巴管内皮细胞的迁移,而对淋巴管内皮细胞的增殖无明显影响。VEGF-C对于淋巴管内皮细胞增殖和迁移的作用比bFGF和VEGF强。实验结果表明,VEGF-C在淋巴管新生的关键步骤即内皮细胞的增殖和迁移方面具有重要作用。VEGFR-1和VEGFR-2是VEGF-A和VEGF-B的受体,介导血管新生。VEGFR-3是VEGF-C和VEGF-D的特异性受体,在淋巴管内皮细胞表达。我们观察到,体外培养的淋巴管内皮细胞的细胞膜表达VEGFR-3,提示VEGF-C通过VEGFR-3的介导作用促进淋巴管内皮的增殖和迁移。关于VEGFR-3介导的VEGF-C和VEGF-D对于淋巴管新生的作用机制有待于进一步研究。迁移的细胞出现头部和尾部,头部伸出板状伪足和丝状伪足。细胞极性的出现和细胞运动都依赖于肌动蛋白的重组。已研究发现,VEGF引起的内皮细胞迁移基于肌动蛋白的构型改变。有人观察到,在静止状态下淋巴管内皮细胞的F-肌动蛋白主要位于细胞周边部,中央部存在较短的F-肌动蛋白束。我们观察到,VEGF-C的作