地衣芽孢杆菌s-菌株发酵条件的优化

地衣芽孢杆菌s-菌株发酵条件的优化

0芽孢杆菌的应用[研究意义]是指促进肠内菌群生态平衡，对主枝有用的微生物。在畜禽养殖中使用益生菌不仅可避免长期使用抗生素引起的肠道微生态平衡的破坏、耐药菌株的产生及药物残留等问题,而且还具有提高动物生产性能和免疫力,对动物无毒无害及畜产品中无残留等特点。1989年美国食品与药物管理局(FDA)公布了42种可直接用于畜禽生产的微生物,应用较多的为乳酸杆菌、粪链球菌、酵母菌、芽孢杆菌。从动物生产和饲料工业特点看,芽孢杆菌比其他有益微生物有更多的优点,因而其研究和应用受到广泛重视。【前人研究进展】目前枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌应用较多。由地衣芽孢杆菌制备而成的微生态制剂具有如下优良特性:(1)能调节动物肠道菌群平衡,改善肠道微生态环境,促进动物生长和提高抗病力。(2)在不利环境条件下能以孢子形式存在,在饲料制粒、贮存及胃酸环境中仍能保持高活性。(3)能刺激动物免疫器官的生长发育,激活淋巴细胞,提高免疫球蛋白和抗体水平,增强细胞免疫和体液免疫功能,提高机体免疫力。(4)能自身合成消化性酶类,如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和纤维素酶等,与内源消化酶共同发挥作用,促进养分的消化吸收。【本研究切入点】地衣芽孢杆菌TS-Ⅱ菌株发酵培养基组分及优化条件尚不确定。【拟解决关键问题】以自行分离筛选的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)TS-Ⅱ菌株为研究对象,对其摇瓶发酵培养基及发酵条件进行优化。为其规模化发酵生产提供依据。1材料和方法1.1材料表面1.1.1材料表面菌种为新疆天山北坡牧场中分离筛选的地衣芽抱杆菌(Bacilluslichenlformis)TS-Ⅱ菌株。1.1.2培养基1.1.2.温灭菌、冷却蛋白胨10g,NaCl10g,酵母粉5g,水1000mL,不调节pH值,121℃高温灭菌25min。基础发酵培养基(葡萄糖铵盐培养基):葡萄糖10g、(NH4)2HPO44g、NaCl5g、K2HPO42g、MgSO41g、CaCl20.4g、FeSO40.02g、MnSO40.01g,水1000mL,调pH至7.0,121℃高温灭菌25min。1.1.2.2.表面活性剂蛋白胨10g,NaCl10g,酵母粉5g,琼脂15g,水1000mL,调pH至6.0,121℃高温灭菌25min。1.2方法1.2.1细菌激活将已保存的地衣芽孢杆菌TS-Ⅱ菌种活化后转接到斜面培养基,37℃培养24h,备用。1.2.2种子溶液的制备取一环活化菌种,接入装有50mL种子培养基的250mL三角瓶中,37℃,180r/min培养18h。1.2.3养基、三角瓶的接种量分别取1mL种子液,接入装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中(接种量为2%,V/V)。置37℃摇床中振荡培养,转速为200r/min,进行单因素和正交实验的发酵条件研究。1.2.4单因素培养基实验1.2.4.碳源和建立碳源培养基分别用1%(葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、可溶性淀粉、甘油)替代基础培养基中的碳源制成培养基。采用摇瓶发酵培养条件,12h后测定发酵液中的活菌含量,以确定最佳碳源。1.2.4.无机碳源的替代分别用1%(蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、胰蛋白胨、尿素、(NH4)2SO4、NH4NO3、(NH4)2HPO4、玉米浆、尿素)替代基础培养基中的无机碳源。采用摇瓶发酵培养条件,12h后测定发酵液中的活菌含量,以确定最佳氮源。1.2.4.无机对ts-菌株生长的影响鉴于基础发酵培养基中含有多种无机盐,为研究其对于TS-Ⅱ菌株生长的影响,分别用浓度为0.2%NaCl、K2HPO4、MgSO4、CaCl2、FeSO4、MnSO4及不加无机盐的空白,与上述实验所确定的最佳碳氮源配比,采用摇瓶发酵培养条件,12h后测定发酵液中的活菌含量,以确定各种无机盐对于TS-Ⅱ菌株生长的影响。1.2.4.碳源浓度对发酵的影响在确定上述最佳氮源和无机盐浓度不变的情况下,最佳碳源浓度分别为0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%,采用摇瓶发酵培养条件,12h后测定发酵液中的活菌含量,以确定最佳碳源浓度。1.2.4.最佳氮源浓度确定在确定上述最佳碳源和无机盐浓度不变的情况下,最佳氮源浓度分别为0.5%、2%、4%、6%、8%、10%,采用摇瓶发酵培养条件,12h后测定发酵液中的活菌含量,以确定最佳氮源浓度。1.2.4.无机盐浓度对酵母菌生长的影响在确定上述最佳碳氮源浓度不变的情况下,选取对TS-Ⅱ菌株生长有显著影响的无机盐,浓度分别为0.5%、2%、4%、6%、8%、10%,采用摇瓶发酵培养条件,12h后测定发酵液中的活菌含量,以确定最佳无机盐浓度。1.2.5正交实验结果将筛选出的最佳的碳源、氮源和无机盐3个重要因素,在分别确定的最佳浓度左右浮动作为3个水平,选用3因素3水平L9(33)正交表进行实验,以做进一步优化,采用正交软件助手对正交实验结果进行方差分析。表1,表21.2.6培养基的制备取1mL培养好的种子液接种于盛有50mL最优化培养基的250mL三角瓶中,采用摇瓶发酵培养条件振荡培养24h,自接种后每2h取样1次测定菌液的OD值(600nm),用未接种培养基作为空白对照。1.2.7发酵条件优化采用最适培养基配方,固定摇瓶培养的其他发酵条件后,对初始pH、温度、装液量及接种量进行逐一优化。1.2.7.初始ph值的确定在最优培养基的条件下以2mol/LHCl或3mol/LNaOH调节培养基初始pH为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0,接种量2%(V/V),37℃摇床中振荡培养12h,转速为200r/min,取样测定发酵液中的活菌含量,确定最适初始pH值。1.2.7.培养温度的确定在最优培养基,最适初始pH值的条件下,分别在30、35、40、45、50和55℃摇床中振荡培养12h,转速为200r/min,接种量2%(V/V),取样测定发酵液中的活菌含量,确定最适培养温度。1.2.7.装液量的确定最适初始pH值和最适温度的条件下,在250mL的三角瓶分别装入10、20、30、40、50和60mL的最优培养基,接种量2%(V/V),转速为200r/min,培养12h后取样测定发酵液中的活菌含量,确定最适装液量。1.2.7.接种量的确定最适初始pH值和最适温度的条件下,在250mL的三角瓶分别装入最适装液量的最优培养基,接种量分别为0.5%、1%、2%、3%、4%、5%,转速200r/min,培养12h后取样测定发酵液中的活菌含量,确定最适接种量。1.2.8测量活菌总数测定采用稀释平板计数法;菌体生长曲线的测定采用比浊法,测定菌液的OD(600nm);pH测定仪测定菌液pH。2结果与分析2.1发酵培养基的优化2.1.1发酵液中活菌测定分别以1%葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、可溶性淀粉、甘油作为碳源,其他组分均相同进行发酵。用稀释平板计数法测定发酵液中的活菌含量。确定最佳碳源后,分别以不同浓度,其他组分均相同的条件进行发酵,测定发酵液中的活菌含量。葡萄糖、蔗糖和甘油为碳源时地衣芽孢杆菌TS-Ⅱ菌株的生长明显优于可溶性淀粉、乳糖和果糖,利用前三种培养基发酵后,该菌活菌数超过2.0×1010CFU/mL。而利用乳糖发酵后其活菌数在0.5×1010CFU/mL以下,说明地衣芽孢杆菌TS-Ⅱ菌株不能利用乳糖发酵,利用葡萄糖和蔗糖的能力优于果糖。该菌生长的最佳碳源是蔗糖,其次是葡萄糖。蔗糖浓度在6%时,地衣芽孢杆菌TS-Ⅱ菌株生长最佳,活菌数达到2.52×1010CFU/mL。图1,图22.1.2发酵液中活菌含量的测定以6%蔗糖为碳源,分别以1%蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、胰蛋白胨、尿素、(NH4)2SO4、NH4NO3、(NH4)2HPO4、玉米浆、尿素为氮源,其他组分均相同进行发酵。用稀释平板计数法测定发酵液中的活菌含量。确定最佳氮源后,分别以不同浓度,其他组分均相同的条件进行发酵,测定发酵液中的活菌含量。氮源为有机氮源时地衣芽孢杆菌TS-Ⅱ菌株的生长明显优于无机氮源。利用有机氮源发酵后,该菌活菌数都超过2.5×1010CFU/mL,而利用无机氮源时的活菌数在1.0×1010CFU/mL以下,说明地衣芽孢杆菌TS-Ⅱ菌株利用有机氮源的能力优于利用无机氮源。该菌生长的最适氮源是蛋白胨,这与蛋白胨富含氨基酸、维生素及生长因子有关。蛋白胨浓度在4%时,地衣芽孢杆菌TS-Ⅱ菌株生长最佳,活菌数达到3.63×1010CFU/mL。图3,图42.1.3发酵条件对地衣芽孢杆菌ts-活菌的影响分别以6%蔗糖和4%蛋白胨为碳源和氮源,以不加无机盐为空白,在此基础上分别加入0.2%NaCl、K2HPO4、MgSO4、CaCl2、FeSO4、MnSO4进行发酵,用稀释平板计数法测定发酵液中的活菌含量。选取影响最为显著的无机盐,分别以不同浓度,其他组分均相同的条件进行发酵,测定发酵液中的活菌含量。NaCl、K2HPO4、MgSO4、FeSO4、MnSO4均高于对照组,说明NaCl、K2HPO4、MgSO4、FeSO4、MnSO4对地衣芽孢杆菌TS-Ⅱ菌株的生长有促进作用,其中活菌数最高的为NaCl,达到2.85×1010CFU/mL,而CaCl2发酵后的活菌数值低于对照组,说明CaCl2不能促进地衣芽孢杆菌TS-Ⅱ菌株的生长。NaCl浓度在4%以下时,地衣芽孢杆菌TS-Ⅱ菌株的活菌数随浓度的升高而增大,NaCl浓度达到4%时,地衣芽孢杆菌TS-Ⅱ菌株生长最佳,活菌数达到3.96×1010CFU/mL,NaCl浓度高于4%时,该菌的活菌数随浓度的升高迅速降低,说明较高的Na+浓度会抑制地衣芽孢杆菌的生长。图5,图62.1.4培养基配方优化培养基中各组分之间有一定的内在关系,在单因素实验的基础上,采用正交实验以寻求培养基中各组分的最佳配比。实验条件下优化水平的最佳组合为A2B1C2。即地衣芽孢杆菌TS-Ⅱ菌株的最佳培养基配方为蔗糖6%、蛋白胨3%和NaCl3%。极差分析可知,RB>RA>RC,各因子对活菌数含量影响大小为蛋白胨>蔗糖>NaCl。表1,表22.2生长稳定期期发酵培养0~2h为地衣芽孢杆菌的生长停滞期,细菌数量极少;自2h以后进入对数生长期,菌体数量急剧增多;在12h达到生长高峰期,10~12h为地衣芽孢杆菌TS-Ⅱ菌株生长的稳定期,菌体生长缓慢。自12h后细菌数量开始减少,地衣芽孢杆菌TS-Ⅱ菌株进入生长衰亡期。因此,采用10~12h时的菌液作为菌种较合适,此时地衣芽孢杆菌TS-Ⅱ菌株为对数生长末期,既可保持高的细胞活力,又可获得尽可能多的细胞数。图72.3发酵条件优化2.3.1培养初始ph的确定pH值主要通过影响菌体细胞膜电荷、膜渗透性及营养物质离子化程度,从而影响菌体对养分的吸收。由于摇瓶发酵过程中的pH难以控制,只能控制发酵液的初始pH。因此,实验在配制了最佳培养基后,将初始pH分别调至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0,在摇瓶发酵培养条件下培养12h,用稀释平板计数法测其活菌数。在初始pH5~7地衣芽孢杆菌TS-Ⅱ菌株均可良好生长,pH为5.5时生长最好,但随pH的增大,活菌数呈下降趋势,说明地衣芽孢杆菌TS-Ⅱ菌株适宜在酸性环境中生长。图82.3.2酶活性的影响温度主要通过改变酶反应速率来影响菌体的生长。一般培养基温度升高,酶反应速率增大,生长代谢加快,生产期提前。但酶很容易因过热而失去活性,表现为菌体容易衰老,影响最终产量。选取30、35、40、45、50和55℃作为摇床温度分别测定不同温度对发酵液活菌数的影响,在摇瓶发酵培养条件下培养12h,用稀释平板计数法测其活菌数。由地衣芽孢杆菌TS-Ⅱ菌株在35~45℃均可良好生长,其生长的最适温度为35℃。图92.3.4发酵液活菌数测定分别选取0.5%、1%、2%、3%、4%、5%接种量,测定不同接种量对发酵液活菌数的影响,在摇瓶发酵培养条件下培养12h,用稀释平板计数法测其活菌数。地衣芽孢杆菌TS-Ⅱ菌株生长的最适接种量为0.5%,随接种量的增大,地衣芽孢杆菌TS-Ⅱ菌株的活菌数减小。图113khpo42、meso40、mnso40的mnso40的mnso-40.3采用正交实验设计分析对地衣芽孢杆菌TS-Ⅱ菌株发酵培养基成分进行的优化,确定TS-Ⅱ菌株发酵培养基的最佳组分为(g/L):蔗糖60、蛋白胨30、NaCl30、K2HPO42、MgSO41、FeSO40.02、MnSO40.01。对发酵条件进行了研究,发现初始pH值、培养温度和装液量是影响TS-Ⅱ菌株发酵生产水平的重要因素,发酵的最适初始pH值为5.5,最适培养温度为35℃,最适装液量为10mL(250mL)三角瓶,通过优化培养基组分和培养条件,使地衣芽孢杆菌TS-Ⅱ菌株活菌数显著提高,达到了